23 pekat, raksa II klorida, bismut III nitrat, besi III klorida, timbal II asetat,
kalium iodida, kloralhidrat, asam asetat anhidrida, natrium hidroksida, amil alkohol, natrium sulfat anhidrat, serbuk magnesium.
3.2 Hewan Percobaan
Hewan yang digunakan pada penelitian ini adalah mencit jantan Mus musculus berumur 6 – 8 minggu dengan bobot badan 25 – 30 g yang diperoleh
dari Laboratorium Farmakologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara USU. Hewan ini diaklimatisasi selama 1 satu minggu dengan tujuan untuk
menyeragamkan makanan dan hidupnya dengan kondisi yang serba sama sehingga dianggap memenuhi syarat untuk penelitian.
3.3 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan oleh Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI
Bogor, Indonesia.
3.4 Pembuatan Pereaksi
3.4.1 Pereaksi Asam Klorida 2 N
Sebanyak 17 ml asam klorida pekat ditambahkan dengan air suling hingga diperoleh 100 ml
Ditjen POM
a
, 1995.
3.4.2 Pereaksi Natrium Hidroksida 2 N
Sebanyak 8 g natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Ditjen POM
a
, 1995.
Universitas sumatera utara Universitas sumatera utara
24
3.4.3 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, dilarutkan dalam air suling secukupnya, lalu ditambahkan 2 g iodium kemudian ditambahkan air suling
hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM
a
, 1995.
3.4.3 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,4 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml, pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 10
ml air suling, kedua larutan dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM
a
, 1995.
3.4.4 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 0,8 g bismut III nitrat ditimbang, dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat pekat, pada wadah lain ditimbang sebanyak 27,2 g kalium iodida, dilarutkan
dalam 50 ml air suling, kemudian kedua larutan dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan yang jernih diambil dan diencerkan dengan
air suling hingga volume larutan 100 ml Ditjen POM
a
, 1995.
3.4.5 Pereaksi Besi III Klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air secukupnya hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM
a
, 1995.
3.4.6 Pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak 20 bagian asam asetat anhidrida dicampur dengan 1 bagian asam sulfat pekat. Larutan pereaksi ini harus dibuat baru Ditjen POM
a
, 1995.
Universitas sumatera utara Universitas sumatera utara
25
3.4.7 Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g α-naftol ditimbang, dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM
a
, 1995.
3.4.8 Pereaksi Timbal II Asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida sebanyak 100 ml Ditjen POM
a
, 1995.
3.4.9 Pereaksi Asam Sulfat 2 N
Sebanyak 5,4 ml larutan asam sulfat pekat diencerkan dengan air suling sampai 100 ml Ditjen POM
a
, 1995.
3.4.10 Larutan Kloralhidrat
Sebanyak 8 gram kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 10 ml air suling Ditjen POM
a
, 1995.
3.5 Pengumpulan dan Pembuatan Simplisia
3.5.1 Pengumpulan Sampel
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun kelor yang diambil dari Desa Juli, Kecamatan Kota Juang, Kabupaten Bireuen, Provinsi
Nanggroe Aceh Darussalam. Daun yang diambil sebagai sampel adalah daun kelor yang tidak terlalu muda dan tidak terlalu tua.
3.5.2 Pembuatan Simplisia
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah daun kelor. Daun dicuci hingga bersih untuk menghilangkan pengotor lainnya, kemudian ditiriskan dan
ditimbang. Diperoleh berat basah. Selanjutnya daun tersebut dikeringkan di dalam
Universitas sumatera utara Universitas sumatera utara
26 lemari pengering sampai daun kering. Simplisia yang telah kering ditimbang,
kemudian diblender menjadi serbuk, lalu dimasukkan ke dalam kantung plastik dan disimpan pada suhu kamar.
3.6 Karakterisasi Simplisia dan Ekstrak
Pemeriksaan karakterisasi simplisia dan ekstrak meliputi pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar abu total,
penetapan kadar abu tidak larut asam, penetapan kadar sari larut air, penetapan kadar sari larut etanol.
3.6.1 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan cara mengamati warna, bentuk, ukuran dan tekstur dari simplisia.
3.6.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik terhadap simplisia dilakukan dengan cara menaburkan serbuk simplisia di atas kaca objek yang telah diteteskan dengan
larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup kemudian diamati di bawah mikroskop.
3.6.3 Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluena. Cara Kerja: toluena sebanyak 200 ml dan air suling sebanyak 2 ml
dimasukkan ke dalam labu alas bulat, didestilasi selama 2 jam. Toluena didinginkan selama 30 menit dan volume air dalam tabung penerima dibaca.
Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisiaekstrak yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah
toluena mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes tiap detik sampai sebagian
Universitas sumatera utara Universitas sumatera utara
27 besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap
detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima
dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluena memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air
yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen Ditjen POM
b
, 1995.
3.6.4 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Air
Sebanyak 5 g serbuk simplisiaekstrak dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1000 ml dalam
labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan
sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan dalam oven pada suhu 105
o
C sampai diperoleh bobot konstan. Kadar sari yang larut di dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di
udara Ditjen POM
b
, 1995.
3.6.5 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisiaekstrak yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil
dikocok sesekali selama 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan
dangkal berdasar rata yang telah ditara. Sisa dipanaskan dalam oven pada suhu 105
o
C sampai diperoleh bobot konstan. Kadar sari yang larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM
b
, 1995.
Universitas sumatera utara Universitas sumatera utara
28
3.6.6 Penetapan Kadar Abu Total
Sebanyak 2 g serbuk simplisiaekstrak yang telah ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselen yang telah dipijar dan ditara, kemudian
diratakan. Krus dipijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu total dihitung
terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM
b
, 1995.
3.6.7 Penetapan Kadar Abu Tidak Larut Asam
Abu yang telah diperoleh dari penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida 2 N selama 5 menit. Bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring, dipijarkan hingga bobot tetap kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam
dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM
b
, 1995. 3.7 Pemeriksaan Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak
3.7.1 Pemeriksaan Alkaloida
Serbuk simplisiaekstrak ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama
2 menit, didinginkan lalu disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut: a.
filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Mayer akan terbentuk endapan berwarna putih atau kuning.
b. filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Bouchardat akan
terbentuk endapan berwarna coklat-kehitaman. c.
filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Dragendorff akan terbentuk endapan berwarna merah atau jingga.
Universitas sumatera utara Universitas sumatera utara
29 Alkaloida dinyatakan positif jika terjadi endapan atau paling sedikit dua
atau tiga dari percobaan di atas Ditjen POM
b
, 1995.
3.7.2 Pemeriksaan Flavonoida
Sebanyak 10 g serbuk simplisiaekstrak ditambahkan 10 ml air, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml filtrat
ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi warna
merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.
3.7.3 Pemeriksaan Tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisiaekstrak disari dengan 10 ml air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna.
Diambil 2 ml larutan lalu ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida. Terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth,
1966.
3.7.4 Pemeriksaan Glikosida
Serbuk simplisiaekstrak ditimbang sebanyak 3 g kemudian disari dengan 30 ml campuran 7 bagian volume etanol 96 dan 3 bagian volume air suling,
selanjutnya ditambahkan 10 ml HCl 2 N, direfluks selama 10 menit, didinginkan dan disaring. Pada 30 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II
asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat disari sebanyak 3 kali, tiap kali dengan 20 ml campuran 3 bagian volume kloroform dan
2 bagian volume isopropanol, lalu hasilnya dikumpulkan. Diambil lapisan air kemudian ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molisch, ditambahkan secara
Universitas sumatera utara Universitas sumatera utara
30 hati-hati 2 ml asam sulfat pekat terbentuk cincin warna ungu pada batas kedua
cairan menunjukkan adanya ikatan gula Ditjen POM
b
, 1995.
3.7.5 Pemeriksaan Saponin
Sebanyak 0,5 g simplisiaekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat
selama 10 detik, timbul busa yang mantap tidak kurang dari 10 menit setinggi 1 – 10 cm. Ditambahkan 1 tetes larutan asam klorida 2 N, bila buih tidak hilang
menunjukkan adanya saponin Ditjen POM
b
, 1995.
3.7.6 Pemeriksaan SteroidaTriterpenoida
Sebanyak 1 g simplisiaekstrak dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa dalam cawan
penguap ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat. Timbul warna ungu atau merah kemudian berubah menjadi hijau biru
menunjukkan adanya steroidatriterpenoida Harborne, 1987. 3.8
Tahapan Persiapan Percobaan 3.8.1 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Kelor
Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi. Langkah pembuatan ekstrak etanol daun kelor adalah sebagai berikut: Ekstrak dibuat dengan cara
maserasi menggunakan etanol 96. Serbuk simplisia dimaserasi dengan etanol, dilakukan dengan cara 10 bagian simplisia dengan derajat halus yang cocok
dimasukkan ke dalam bejana, kemudian dituangi dengan 75 bagian cairan etanol, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, sambil berulang-ulang
diaduk. Setelah 5 hari sari diserkai saring, ampas diperas. Ampas ditambah cairan penyari secukupnya diaduk dan diserkai, sehingga diperoleh seluruh sari
Universitas sumatera utara Universitas sumatera utara
31 sebanyak 100 bagian. Bejana ditutup, dibiarkan ditempat sejuk, terlindung dari
cahaya, selama 2 hari. Kemudian endapan dipisahkan. Hasil maserat yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan bantuan alat rotary evaporator
sehingga diperoleh ekstrak etanol Ditjen POM, 1979.
3.8.2 Pembuatan Suspensi CMC Na 0,5
Sebanyak 0,5 g CMC ditaburkan dalam lumpang yang berisi 10 ml akuades panas. Didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh massa yang
transparan. Setelah dikembangkan, digerus hingga terbentuk gel lalu diencerkan dengan sedikit air. Kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml.
Volumenya dicukupkan dengan akuades hingga garis tanda Anief, 1997.
3.8.3 Pembuatan Suspensi Metotreksat 0,025
Suspensi Metotreksat 0,025 dibuat dengan cara menggerus 1 tablet metotreksat 2,5 mg di dalam lumpang. Kemudian ditambahkan sedikit larutan
CMC 0,5, digerus sampai homogen. Dituang ke dalam labu tentukur 10 ml, kemudian dicukupkan volumenya dengan larutan CMC 0,5 sampai garis tanda.
3.8.4 Pembuatan Suspensi Ekstrak Etanol Daun Kelor 1
Ekstrak etanol daun kelor ditimbang sesuai dengan konsentrasi yang diinginkan. Kemudian dimasukkan ke dalam lumpang, dan ditambahkan suspensi
CMC Na 0,5 lalu digerus hingga merata. Sediaan suspensi ekstrak etanol daun kelor dimasukkan ke dalam labu ukur, kemudian ditambahkan suspensi CMC Na
0,5 ke dalam labu hingga dicapai batas volume untuk mendapatkan konsentrasi yang diinginkan.
Universitas sumatera utara Universitas sumatera utara
32
3.9 Tahap pengujian
Sebelum diberi perlakuan mencit ditimbang dengan bobot rata-rata mencit 20 g. Hewan uji di bagi menjadi 5 kelompok. Pada tiap mencit diberi dengan dosis
yang berbeda. Untuk mendapatkan data yang valid dilakukan pengulangan menggunakan rumus Federer Kusriningrum, 1989.
n - 1 t - 1 ≥ 15
n - 1 5 - 1 ≥ 15
4n – 4 ≥ 15
4n ≥ 15 + 4
n ≥ 194 = 4,5
Adapun perlakuan terhadap hewan uji pada masing-masing kelompok, yaitu:
1. Kelompok blanko: tidak diberi perlakuannormal.
2. Kelompok 1: Kontrol negatif yaitu mencit diberi suspensi CMC Na 0,5 bb
secara per oral selama 10 hari. 3.
Kelompok 2: Kontrol positif yaitu mencit pada hari ke-6 sampai hari ke-10 diberikan Metotreksat 1,3 mgkg bb secara per oral.
4. Kelompok 3: Kelompok perlakuan dengan pemberian suspensi ekstrak
etanol daun kelor dosis 100 mgkg bb selama 10 hari lalu pada hari ke-6 sampai hari ke-10 diberikan Metotreksat 1,3 mgkg bb secara per oral.
5. Kelompok 4: Kelompok perlakuan dengan pemberian suspensi ekstrak etanol daun kelor dosis 200 mgkg bb selama 10 hari lalu pada hari ke-6 sampai
hari ke-10 diberikan Metotreksat 1,3 mgkg bb secara per oral.
Universitas sumatera utara Universitas sumatera utara
33 Pada hari ke-11 dilakukan pengambilan sampel darah dari ekor mencit.
Kemudian dilakukan pemeriksaan hitung trombosit dengan menggunakan alat hemositometer.
3.10 Pemeriksaan Trombosit
Pengamatan sel trombosit digunakan alat hemositometer. Hisap larutan pengencer Larutan Rees Ecker sampai angka 1, lalu buang cairan tersebut. Ekor
mencit dilukai dengan pisau steril sehingga mengeluarkan darah. Tetes darah pertama dibuang, tetes darah berikutnya dihisap dengan hemositometer sampai
batas 0,5. Hisap larutan Rees Ecker sampai angka 101, kemudian suspensi dikocok selama 2 – 3 menit. Kamar hitung dan gelas penutup dibersihkan,
kemudian gelas penutup dipasang di atas kamar hitung. Tetes pertama dibuang terlebih dahulu, lalu campuran diteteskan pada kamar hitung dan dibiarkan selama
2 menit. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop. Perhitungan trombosit dilakukan bidang berukuran 1 x 1 mm
3
. Jumlah trombosit dihitung dengan persamaan:
Jumlah trombositmm
3
= jumlah trombosit x 2000 Gandasoebrata, 1985.
3.11 Analisis Statistik
