Identifikasi variabel :
Variabel bebas independent : infeksi H.pylori Variabel terikat dependent : profil lipid
3.5. Perkiraan Besar Sampel
Sampel dipilih secara cross sectional dengan perkiraan besar sampel minimum dan subjek yang diteliti dipakai rumus :
n1 = n2 = dimana :
- Z 1 - α 2 = deviat baku alpha yang ditentukan dengan
table z, untuk α = 0,05 Z1 - α 2 = 1,96
- Z1 – β = deviat baku beta yang ditentukan dengan table z, untuk
β = 0,10 Z 1 – β = 1,282 - P = P1 + P2
2 - P = proporsi penderita dispepsia yang HP + = 0,1
- P1 – P2 = beda proporsi yang bermakna, ditetapkan besarnya = 0,35
Z 1 - α2 √ 2.P 1 – P + Z1 – β √P1 1 – P1 +P2 1 – P2
P1 –P2
2
Universitas Sumatera Utara
- P2 = Perkiraan besar proporsi penderita dispepsia yang diteliti = 0,45
Dan di dapat besar sampel minimal untuk masing – masing kelompok adalah 28 orang.
3.6. Bahan dan Cara kerja 3.6.1. Bahan dan pengolahan sampel
Dalam penelitian ini ada dua bahan yang akan diperiksa, yaitu untuk pemeriksaan H.pylori, sampel yang dipakai adalah feses dan akan
dijelaskan di bawah. Untuk pemeriksaan lainnya, sampel yang dipakai adalah darah vena pasien yang sebelumnya dipuasakan minimal 12 jam.
3.6.2. Pemeriksaan stool antigen helicobacter
Sampel yang dipakai adalah feses. Persiapan sebelum dilakukan pemeriksaan :
- Diet sehari-hari seperti biasa. - Feses yang diambil adalah feses pagi atau feses pertama.
- Tidak boleh menggunakan laxatif. - Feses diletakan di dalam container yang telah disediakan.
- Feses yang diambil dari kloset harus bagian atas dari feses. - Feses tidak boleh terkena urin karena akan menyebabkan
kontaminasi.
Universitas Sumatera Utara
Prinsip kerja :
H.pylori antigen rapid test ini menggunakan tehnik immunocromatografi.
Feses diencerkan dan dimasukkan ke sumur dari kaset test. Sampel akan mengalir melalui lembaran label yang mengandung
antibodi H.pylori yang berikatan dengan koloid emas. Jika sampel mengandung antigen H.pylori, antigen akan berikatan dengan
antibodi yang melapisi partikel koloid emas dan membentuk kompleks antigen-antibodi-emas. Kompleks ini akan bergerak di
atas membran nitroselulosa dengan cara kapileri menuju garis test. Jika kompleks tadi mencapai garis test, mereka akan berikatan
dengan antibodi pada membran dan membentuk garis ungu. Jika antigen H.pylori tidak ada dalam sampel, atau kadarnya sangat
rendah, di bawah limit deteksi, maka yang muncul garis kontrol. Antigen rapid test kit ini memiliki 2 garis hasil yaitu “T” H. Pylori Ag
Test Line dan “C” Control Line, dimana keduanya tidak akan
terlihat sebelum sampel dibubuhkan. Control line digunakan sebagai prosedur kontrol dan akan muncul
bila prosedur pemakaian test dilakukan dengan benar..
Bahan-bahan yang ada di SD H.pylori antigen : 1. H.pylory Ag kit terdiri dari: assay diluent 25mlvial, sample
collection tube, sample collection swab, disposable droppe r.
Universitas Sumatera Utara
2. Zat aktif yang terdiri dari : - Alat tes mengandung : mouse monoclonal anti Helicobacter pylori-
gold conjugate 0,12 ± 0,024µg, Test line mouse monoclonal anti
H.pylori 0,64 ± 0,128µg, Control line Goat anti-mause IgG 0,64
± 0,128µg - Buffer assay mengandung : phosphate buffer 20mM, Bovine
serum albumin 1, Sodium azide 0,01, Sodium chloride
0,1M, Tween 20 0,1 Stabilitas dan penyimpanan rapid test kit
- Sebaiknya disimpan pada suhu 1 - 30ºC - Test ini sensitif terhadap kelembapan dan panas
- Segera gunakan test setelah dikeluarkan dari foil pouch - Jangan digunakan bila sudah kadaluarsa
- Jangan disimpan dikulkas, jangan dibekukan
Pengumpulan dan penyimpanan sampel: Ambil sekitar 50mg feses, dengan memasukkan swabkapas yang
steril ke feses, kemudian masukkan swab kedalam sample collection tube
yang mengandung assay diluent. Putar swab setidaknya 10 kali sampai sample larut kedalam
diluents dan buang swab sambil memeras swab melawan dinding tube dan tutup.
Universitas Sumatera Utara
Sampel sebaiknya segera diperiksa , jangan menggunakan segala jenis media transport untuk menyimpan atau membawa sampel.
Sampel feses boleh disimpan dalam kulkas pada suhu 2 – 8 ºC selama 72 jam, jika diperlukan penyimpanan lebih lama dapat
dibekukan pada suhu -20ºC. Sampel feses yang akan segera diperiksa sebaiknya dimasukkan
kedalam container yang tidak mengandung bahan pengawet karena dapat mempengaruhi hasil tes.
Prosedur pelaksanaan tes : 1. Biarkan test dan sampel yang akan diperiksa dalam suhu ruangan
2. Ambil assay diluents sampai garis batas dan pindahkan ke sample collection tube
, lakukan 2x. 3.
Ambil kira-kira 50mg feses dengan menggunakan sample collection swab.
4. Masukkan swab tadi kedalam sample collection tube yang berisi assay diluents
5. Putar-putar swab setidaknya 10x sampai sample larut kedalam assay diluents dan keluarkan swab sambil mengoles berlawanan
dengan dinding tube. 6. Biarkan selama 5 menit
7. Tutup sample collection tube dengan dropping cap
Universitas Sumatera Utara
8. Keluarkan test dari foil pouch dan letakkan di tempat yang kering dan datar
9. Masukkan 3 tetes ±100µl kedalam sumur sampel, kemudian akan terlihat warna ungu bergerak sepanjang garis hasil di tengah tes
10. Interpretasi hasil tes dalam 10 – 15 menit. tidak boleh lebih dari 15 menit
Interpretasi dari tes : • Sebuah pitaband berwarna ungu akan muncul di sebelah kiri dari
jendela hasil yang menunjukkan bahwa tes dilakukan dengan tepat. Pita ini adalah Control band.
• Sisi kanan dari jendela hasil adalah hasil tes, jika pita berwarna ungu muncul di sebelah kanan pita ini adalah Tes band.
• Hasil Negatif - : jika yang muncul hanya control band C. • Hasil Positif + : jika muncul dua garisband berwarna ungu yaitu
tes band T dan control band C, tidak menjadi masalah garis mana yang muncul lebih dahulu.
•
Hasil invalid : jika control band C tidak terlihat setelah sampel dibubuhkan. Terjadinya hasil yang invalid karena tidak mengikuti
petunjuk dengan benar atau test kit rusak karena lewat masa kadaluarsa
.
Universitas Sumatera Utara
Quality kontrol tes kit :
SD Bioline H.pylori Ag tes kit ini memiliki “ Tes line” dan “Control line”pada permukaan kaset. Keduanya tidak akan terlihat sebelum kita
membubuhkan sampel kedalamnya. “Control line’ dipakai sebagai prosedur kontrol. Control line akan selalu muncul jika test dikerjakan
sesuai prosedur dengan tepat dan reagen test dari control line bekerja baik. Pabrik juga menyediakan sampel kontrol positif dan negatif untuk
memastikan kit yang kita gunakan masih dalam keadaan baik.
Universitas Sumatera Utara
Gb. 3.1. Prosedur pemeriksaan HpSA
Universitas Sumatera Utara
3.6.3. Pemeriksaan sampel darah
Pasien sebelumnya dipuasakan sekitar 12 jam, kemudian darah diambil menggunakan venoject dari vena mediana cubiti tanpa stasis vena yang
berlebihan. Tempat punksi harus dibersihkan terlebih dahulu dengan alkohol 70 dan dibiarkan kering. Kemudian punksi dilakukan dengan
menggunakan spuit disposibel sebanyak 3 ml, dimasukkan ke dalam tabung tanpa antikoagulan untuk pemeriksaan. Sampel darah dibiarkan
membeku selama 20 menit dalam suhu ruangan, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 20 menit, serum dipisahkan dan
dimasukkan ke dalam aliquotmikro tube kemudian disimpan dalam freezer pada suhu -20
c sampai terkumpul sejumlah sampel tertentu dan serentak dilakukan pemeriksaan profil lipid.
Pemeriksaan Profil lipid.
Pemeriksaan ini dilakukan dengan metoda enzimatik kolorimetrik dengan Automatic Cobass 6000 C 501. Bahan sampel adalah serum.
Prinsip pemeriksaan masing-masing sebagai berikut : 1. Pemeriksaan Trigliserida
Menggunakan alat Cobas 6000 C 501 Analyzer dengan metode enzimatik kolorimetrik, dengan reaksi :
Trigliserida
lipoprotein lipase
Gliserol + Asam lemak
Universitas Sumatera Utara
Gliserol + ATP
Gliserolkinase
Gliserol-3-pospat + ADP Gliserol-3-pospat + O
2 Gliserol pospat oxidase
Dihidroksiaseton pospat + H
2
O
2
2H
2
O
2
+ 4-aminophenazon + 4-kloropenol
Peroxidase
quinoneimine dye +
4H
2
O Absorbsi warna merah quinoneimine dye diukur pada panjang gelombang
512 nm. 2. Pemeriksaan Cholesterol total
Menggunakan alat Cobas 6000 C 501 analyzer dengan metode enzimatik kolorimetrik, dengan reaksi :
Cholesterol ester + H
2
O
cholesterol esterase
kolesterol + asam lemak Cholesterol + O
2 cholesterol oksidase
cholest- 4- ene-3-one + 4 H
2
O
2
2 H
2
O
2
+ 4-Amino Antipyrine
peroksidase
quinoneimine dye + 4 H
2
O Absorbs warna merah diukur pada panjang gelombang 520 nm
3. Pemeriksaan HDL-C Menggunakan alat Cobas 6000 C 501 analyzer dengan metode
enzimatik kolorimetrik, dengan reaksi : HDL-C ester + H
2
O
detergent cholesterol esterase
kolesterol + Asam lemak bebas HDL-C + O
2 Cholesterol oxidase
∆4-cholestenone + H
2
O
2
2H
2
O
2
+ 4-aminoantipyrine + HSDA + H
+
+ H
2
O
Peroxidase
Purple blue pigment
+ 5H
2
O Absorbsi warna Purple blue pigment diukur pada panjang gelombang 583
nm.
Universitas Sumatera Utara
4. Pemeriksaan LDL-C Menggunakan alat Cobas 6000 C 501 analyzer dengan metode
enzimatik kolorimetrik, dengan reaksi : LDL-C ester + H
2
O
detergent cholesterol esterase
kolesterol + Asam lemak bebas LDL-C + O
2 Cholesterol oxidase
∆4-cholestenone + H
2
O
2
2H
2
O
2
+ 4-aminoantipyrine + HSDA + H
+
+ H
2
O
Peroxidase
Purple blue pigment
+ 5H
2
O Absorbsi warna Purple blue pigment diukur pada panjang gelombang 583
nm.
3.7. Pemantapan mutu
Pemantapan mutu dilakukan setiap kali pada saat awal dilakukan pemeriksaan untuk menjamin ketepatan hasil pemeriksaan yang
dikerjakan, sehingga hasil dari suatu pemeriksaan laboratorium berkualitas baik. Sebelum dilakukan pemeriksaan perlu diperhatikan hal-
hal seperti diantaranya adalah : prosedur pemeriksaan, penggunaan alat- alat yang harus sesuai dengan petunjuk, ataupun reagensia yang
digunakan.
3.7.1. Kalibrasi pemeriksaan laboratorium
Pemantapan kualitas dilakukan dengan cara mengerjakan sampel penelitian bersama-sama dengan assayed control untuk profil lipid dan
diharapkan mencapai nilai target. Bila hasil pemeriksaan assayed control
Universitas Sumatera Utara
untuk profil lipid tidak masuk dalam nilai target, maka dilakukan kalibrasi. Kalibrasi dilakukan dengan menggunakan control sera assay C.f.a.s.
.calibrator for automated system untuk alat Cobas Integra 800 Analyzer.
C.f.a.s. untuk Trigliserida dan Cholesterol digunakan Cat. No. 10759350, Lot. 175192. Untuk pemeriksaan HDL-c dan LDL-c digunakan C.f.a.s
lipids Cat. No. 12172623 122. Kalibrator diencerkan dalam 3 mL
aquabidest dan dihomogenkan dengan cara membalik-balikan botolnya sekitar 10 kali dengan lembut agar tidak terbentuk gelembung udara di
dalam botol, dan dibiarkan selama 30 menit, kemudian lakukan kalibrasi.
3.7.2. Kontrol kualitas pemeriksaan laboratorium
Sebelum dilakukan pemeriksaan profil lipid, dilakukan pemantapan kualitas menggunakan assay control PreciControl ClinChem Multi 1.
Kontrol kualitas pemeriksaan TG dan Cholesterol digunakan precinorm U Cat. No. 16663300. Sedangkan untuk pemeriksaan HDL-C dan LDL-C
digunakan Precinorm Lipid Cat. No. 16663300 Hasil pemeriksaan assay control pada saat pengerjaan sampel
masuk dalam nilai target, maka alat dianggap terkontrol. Setelah itu dilakukan pemeriksaan profil lipid pada sampel penderita dan sampel
kontrol. Selama penelitian, kontrol kualitas pemeriksaan profil lipid dilakukan sebanyak 5 kali bersamaan dengan pemeriksaan sampel, dan
semua assay kontrol masuk ke dalam nilai target.
Universitas Sumatera Utara
Tabel 3.1. Hasil kontrol kualitas pemeriksaan Total Kolesterol, Trigliserida dengan menggunakan precinorm U Cat. Lot. 172688
N Hasil
mgdL target
mgdL N
Hasil mgdL
target mgdL
1 301013
14 93.4
80.6-108.8 14
106.5 89 -119
2 151113
16 89.3
80.6-108.8 16
110.9 89 -119
3 271113
10 90.9
80.6-108.8 10
113.6 89 -119
4 161213
9 91.5
80.6-108.8 9
107.4 89 -119
5 281213
10 88.1
80.6-108.8 10
112.2 89 -119
Jenis pemeriksaan Total Kolesterol
Trigliserida No.
Tanggal pemeriks
aan
Tabel 3.2 Hasil kontrol kualitas pemeriksaan HDL-c, LDL-c dengan Precinorm Lipid
Cat. Lot. 172688
N Hasil
mgdL target
mgdL N
Hasil mgdL
target mgdL
1 301013
14 60.5
45.1-73.9 14
29.9 24.3-39.3
2 151113
16 59.3
45.1-73.9 16
33.7 24.3-39.3
3 271113
10 58.7
45.1-73.9 10
35.5 24.3-39.3
4 161213
9 61.5
45.1-73.9 9
34.7 24.3-39.3
5 281213
10 61.9
45.1-73.9 10
30.8 24.3-39.3
Jenis pemeriksaan LDL-c
HDL-c No.
Tanggal pemeriks
aan
Universitas Sumatera Utara
3.8. Analisa Data
Analisa data dilakukan menggunakan software SPSS Statistical Package for Social Sciences
, Chicago, IL, USA untuk Windows. Untuk menentukan distribusi data seluruh kelompok dilakukan uji Kolmogrof
Smirnov. Untuk melihat perbedaan profil lipid pada pasien dispepsia dengan H.pylori positif dan dispepsia dengan H.pylori negatif dilakukan
uji T Independent dan untuk melihat perbedaan profil lipid ditinjau dari jenis kelamin pada pada pasien dyspepsia dengan H.pylori positif
maupun H.pylori negatif juga digunakan uji T Independent dengan taraf signifikansi p0,05..
3.9. Ethical clearance dan Informed Consent
Ethical clearance diperoleh dari komite Penelitian Bidang Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan,
dengan No. 421KOMETFK USU2013. Inform consent diminta secara tertulis dari subjek penelitian yang menyatakan bersedia ikut dalam
penelitian setelah mendapat penjelasan mengenai maksud dan tujuan dari
penelitian ini.
Universitas Sumatera Utara
3.10. Kerangka kerja
Pasien dispepsia di divisi gastroenterologi di RSUP HAM rawat jalanrawat inap
EKSKLUSI
Dilakukan pemeriksaan feses untuk deteksi antigen dari Helicobacter pylori
HpSA + sebagai kasus
HpSA - sebagai kontrol
Analisis data dan interpretasi kadar profil lipid dari kedua kelompok
Ambil darah dan periksa profil lipid pasien Total kolesterol, Trigliserida, LDL-c, dan HDL-c
Universitas Sumatera Utara
BAB 4 HASIL PENELITIAN
Sampel penelitian berjumlah 59 orang terdiri dari 32 orang pria 54,24 dan 27 orang wanita 45,76 . Dari 59 subjek yang diperiksa,
didapati 28 pasien yang positif terinfeksi HpSA+ terdiri dari 16 orang pria 57,14 dan 12 orang wanita 42,86 yang kemudian dijadikan
kelompok kasus dan 31 pasien yang tidak terinfeksi HpSA- terdiri dari 16 orang pria 51,61 dan 15 orang wanita 48,39 dijadikan sebagai
kelompok pembandingkontrol. Rata-rata umur kelompok dengan HpSA + adalah 46,32±10,41 tahun, dengan rentang umur antara 23-62 tahun,
sedangkan kelompok dengan HpSA - rata-rata umur 49,19±10,28 tahun dengan rentang umur antara 26-64 tahun
Tabel 4.1. Karakteristik kelompok dengan HpSA + dan HpSA-
HpSA + n=28orang HpSA – n=31orang
Rata-rata usia thn 46,32±10,41
49,19±10,28
Jenis kelamin : • Pria
• Wanita 16 57,14
12 42,86 16 51,61
15 48,39
Total kolesterol mgdL
198,25±33,52 176,71±33,63
LDL -c mgdL 138,50±33,86
122,32±34,30
HDL -c mgdL 45,61±17,60
46,32±13,89
Trigliserida mgdL 159,96±59,21
117,71±46,09
Universitas Sumatera Utara
