20
BAB III METODE PENELITIAN
Penelitianini menggunakan metode eksperimental dengan tahapan penelitian meliputi pengumpulan dan pengolahan bahan tumbuhan, identifikasi
bahan tumbuhan, karakterisasi simplisia, skrining fitokimia,pembuatan dan pengujian aktivitas antioksidan dari ekstrak etanol bunga pisang klutuk dengan
metode aktivitas pemerangkapan radikal bebas DPPH 1,1-diphenyl-2- picrylhidrazyl yang diukur secara spektrofotometri UV-Visibel. Penelitian ini
dilakukan di laboratorium fitokimia dan laboratorium penelitian, Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara.
3.1 Alat
Alat-alat yang digunakanpada penelitian ini meliputi alat-alat gelas laboratorium, aluminium foil, blender, desikator, krus porselin, kurs tang, lemari
pengering, mikroskop olympus, seperangkat alat destilasi penetapan kadar air, neraca analitik Boeco Germany, objek gelas, gelas penutup, oven, penangas air,
rotary evaporator stuart, spektofotometer UVVisible Shimadzu UV-1800, stopwatch, tanur Nabertherm.
3.2 Bahan
Bahan yang digunakan adalah bunga pisang klutuk. Bahan bahan kimia berkualitas pro analisis produksi Sigma: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH
Aldrich; vitamin C CSPC Welsheng Pharmaceutical CO., Ltd.; produksi E- Merck, metanol, toluen, raksa II klorida, kalium iodida, bismuth III nitrat,
Universitas Sumatera Utara
21
asam nitrat pekat, besi III klorida, asam klorida pekat, asam sulfat pekat, timbal II asetat, kloralhidrat, kloroform, isopropanol, benzen, asam asetat anhidrit,
natrium hidroksida, amil alkohol, serbuk magnesium Mg, α-naftol, Bahan kimia
berkualitas teknis: Etanol 96 dan air suling.
3.3 Penyiapan Bahan Tumbuhan 3.3.1 Pengumpulan bahan tumbuhan
Tumbuhan yang digunakan adalah bunga pisang klutuk Musa balbisiana BB yang masih segar. Pengambilan sampeldilakukan secara purposif tanpa
membandingkan dengan bahan sampel yang sama dari daerah lain. Sampel diambil dari kebun pisang di Desa Nogio, Kecamatan Delitua, Kabupaten Deli
Serdang,Provinsi Sumatera utara.
3.3.2 Identifikasi tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Lembaga Ilmu Penelitian Indonesia LIPI, Bogor.
3.3.3 Pengolahan bahan tumbuhan
Bahan tumbuhan yang digunakan adalah bunga pisang klutuk. Bunga dibersihkan, dicuci,ditiriskan, kemudian dipotong-potong secara melintang dan
ditimbang sebagai berat basah. selanjutnya bungapisang dikeringkan di lemari pengering pada temperatur± 40ºC, sampai kering dan rapuh,kemudian ditimbang
sebagai berat kering. Simplisia yang telah kering diblender menjadi serbuk lalu disimpan pada suhu kamar dalam kantong plastik untuk mencegah pengaruh
lembab dan pengotoran lain. Bagan kerja penelitian dapat dilihat pada lampiran 2 halaman 44.
Universitas Sumatera Utara
22
3.4 Pembuatan pereaksi 3.4.1 Pereaksi besi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air secukupnya hingga diperoleh larutan 100 mL Depkes, RI.,1995.
3.4.2 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida sebanyak 100 mL Depkes, RI., 1995.
3.4.3 Pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8 g kristal natrium hidroksida dilarutkan dengan air suling
sebanyak 100 mL Depkes, RI., 1995. 3.4.4 Pereaksi asam klorida 2 N
Sebanyak 17 mL larutan asam klorida pekat ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 mL Depkes, RI., 1995.
3.4.5 Pereaksi asam sulfat 2 N
Sebanyak 5,5 mL larutan asam sulfat pekat ditambahkan air suling sampai 100 mL Depkes, RI., 1995.
3.4.6 Pereaksi kloralhidrat
Sebanyak 50 g kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 20 mL air suling Depkes, RI., 1995.
3.4.7 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,4 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 60 mL pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium iodida lalu dilarutkan dalam 10
mL air suling, kedua larutan dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 mL Depkes, RI., 1995.
Universitas Sumatera Utara
23
3.4.8 Pereaksi Mollish
Sebanyak 3 g α-naftol ditimbang, dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh larutan 100 mL Depkes, RI., 1995.
3.4.9 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 0,8 g bismut III nitrat ditimbang, dilarutkan dalam 20 mL asam nitrat pekat, pada wadah lain ditimbang sebanyak 27,2 g kalium iodida,
dilarutkan dalam 50 mL air suling, kemudian kedua larutan dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan yang jernih diambil dan
diencerkan dengan air suling hingga volume larutan 100 mL Depkes, RI., 1995.
3.4.10 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang, dilarutkan dalam air suling secukupnya, lalu ditambahkan 2 g iodium kemudian ditambahkan air suling
hingga diperoleh larutan 100 mL Depkes, RI., 1995.
3.4.11 Pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak 5 bagian volume asam sulfat pekat dicampurkan dengan 50 bagian volume etanol 95. Kemudian ditambahkan dengan hati-hati 5 bagian
volume asam asetat anhidrida ke dalam campuran tersebut dan dinginkan Depkes, RI., 1995.
3.5 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia 3.5.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, tekstur dan ukuran serta pemeriksaan organoleptik dengan mengamati warna, rasa dan
bau dari potongan bunga segar dan simplisia bunga pisang klutuk. Gambar
Universitas Sumatera Utara
24
bungapisang klutuk segar dan serbuk simplisia pisang klutuk dapat dilihat pada Lampiran 3, halaman 45.
3.5.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia bunga pisang klutuk.Serbuk simplisia ditaburkan diatas kaca objek yang telah ditetesi
dengan larutan kloralhidrat dan tutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop. Gambar mikroskopik serbuk simplisia bunga pisang klutuk
dapat dilihat pada Lampiran 4, halaman 46.
3.5.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Alat terdiri dari alas bulat 500 mL, alat penampung, pendingin, pemanas
listrik, tabung penyambung, tabung penerima 5 mL berskala 0,05 mL.
a. Penjenuhan toluen
Sebanyak 200 mL toluena dan 2 mL air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2
jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 mL.
b. Penetapan kadar air simplisia
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia yang telah ditimbangseksama dimasukkan kedalam labu berisi toluene yang telah dijenuhkan, kemudian labu
dipanaskan hati-hati selama 15 menit.Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian
kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik.Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen.Destilasi dilanjutkan
selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu
Universitas Sumatera Utara
25
kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 mL. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan
kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1998.
3.5.4 Penetapan kadar sari yang larut dalam air
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 mL air-kloroform 2,5 mL kloroform dalam air suling sampai 1 liter dalam labu
bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Sejumlah 20 mL filtrat pertama diuapkan
sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di
udara Depkes, RI., 1995.
3.5.5 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 mL etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam
pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 mL filtrat diuapkan sampai kering
dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap.Kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol 96 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara
Depkes, RI., 1995.
3.5.6 Penetapan kadar abu total
Krus porselin ditara, dimasukkan dalam tanur, kemudian dipijar. Sebanyak 2 gram serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus
Universitas Sumatera Utara
26
porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan.Krus porselin dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, didinginkan, ditimbang sampai diperoleh
bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes, RI., 1995.
3.5.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 mL asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam
dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes, RI., 1995.
3.6 Skrining Fitokimia 3.6.1 Pemeriksaan alkaloida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g, ditambahkan 1 mL asam klorida 2 N dan 9 mL air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit,
didinginkan dan disaring, filtrat dipakai untuk uji alkaloida. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalam masing-masing tabung reaksi dimasukkan 0,5 mL filtrat.
Pada tabung I : ditambahkanl 2 tetes pereaksi Mayer, akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning.
Pada tabung II : ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff, akan terbentuk endapan berwarna coklat atau jingga kecoklatan.
Pada tabung III : ditambahkan 2 tetes pereaksi Bourchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai kehitaman.
Alkaloid disebut positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua atau tiga dari percobaan di atas Depkes, RI., 1995
Universitas Sumatera Utara
27
3.6.2 Pemeriksaan glikosida
Sebanyak 3 g serbuk simplisia ditimbang, lalu disari dengan 30 mL campuran dari 7 bagian etanol 96 dan 3 bagian air suling.Kemudiaan direfluks
selama 10 menit, didinginkan, lalu disaring. Diambil 20 mL filtrat, ditambahkan 25 mL air suling dan 25 mL timbal II asetat 0,4 M dikocok, didiamkan 5 menit
lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 mL campuran 2 bagian isopropanol dan 3 bagian kloroform, perlakuan ini diulangi sebanyak 3 kali. Sari air dikumpulkan
dan ditambahkan Natrium sulfat anhidrat, disaring, kemudian diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50
C, sisanya dilarutkan dalam 2 mL metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut: 0,1 mL larutan percobaan dimasukkan
dalam tabung reaksi, kemudian diuapkan di atas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 mL air dan 5 tetes larutan perekasi Molish, lalu ditambahkan
dengan hati-hati 2 mL asam sulfat pekat, terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan, menunjukkan adanya ikatan gula glikon atau glikosida Depkes, RI.,
1995.
3.6.3 Pemeriksaan steroidtriterpenoid
Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan eter 20 mL selama 2 jam, disaring, lalu filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan
20 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Lieberman- Burchard, diteteskan pada saat akan mereaksikan sampel uji. Apabila terbentuk
warna biru atau biru hijau menunjukkan adanya steroida sedangkan warna merah, merah muda atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid Harborne, 1987.
3.6.4 Pemeriksaan flavonoida
Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambah 100 mL air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas. Kedalam 5 mL filtrat
Universitas Sumatera Utara
28
ditambahkan 0,1 g serbuk Mg, 1 mL asam klorida pekat dan 2 mL amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika pada lapisan amil alkohol
terjadi warna merah kekuningan atau jingga Farnsworth, 1966.
3.6.5 Pemeriksaaan tannin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 mL air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil
sebanyak 2 mL dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru atau kehitaman menunjukkan adanya tannin Farnsworth,
1966.
3.6.6 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 mL air suling panas, didinginkan, kemudian dikocok kuat-kuat
selama 10 detik. Saponin positif jika terbentuk busa yang stabil tidak kurang dari 10 menit setinggi 1 sampai 10 cm dan dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2
N buih tidak hilang Depkes, RI., 1995.
3.7 Pembuatan Ekstrak Etanol Bunga Pisang Klutuk EEBPK
Pembuatan ekstrak bunga pisang klutuk dilakukan secara maserasi. Prosedur pembuatan ekstrak : Sebanyak 200 g serbuk simplisia dimasukkan
kedalam wadah kaca, dituangi dengan 1500 mL75 bagian etanol, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya dan sesekali diaduk, setelah 5 hari
campuran tersebut diserkai saring. Ampas dicuci dengan etanol secukupnya hingga diperoleh 2000 mL 100 bagian, lalu dipindahkan dalam bejana tertutup,
dan dibiarkan ditempat sejuk, terlindung dari cahaya selama 2 hari, kemudian di enaptuangkan lalu disaring. Maserat dipekatkan menggunakan alat rotary
Universitas Sumatera Utara
29
evaporatorsuhu 40ºC kemudian dikeringkan menggunakan freeze dryer hingga diperoleh ekstrak kental bunga pisang klutuk Depkes, RI., 1979.
3.8 Pengujian Aktivitas Antioksidan 3.8.1 Prinsip metode pemerangkapan radikal bebas DPPH
Kategori