2 Media semi solid 3 Media cair
2.4.4 Metode Isolasi Biakan Bakteri
a Cara gores Ose yang telah steril dicelupkan ke dalam suspensi mikroorganisme yang
diencerkan, lalu dibuat serangkaian goresan sejajar yang tidak saling menutupi di atas permukaan agar yang telah padat.
b Cara sebar Suspensi mikroorganisme yang telah diencerkan diinokulasikan secara merata
dengan menggunakan hockey stick pada permukaan media padat. c Cara tuang
Pengenceran inokulum yang berturut-turut diletakkan pada cawan petri steril dan dicampurkan dengan medium agar cair, lalu dibiarkan memadat. Koloni
yang berkembang akan tertanam di dalam media tersebut Stanier, RY et al, 1982.
2.4.5 Pengukuran Aktivitas Antimikroba
Penentuan kepekaan bakteria patogen terhadap antimikroba dapat dilakukan dengan salah satu dari dua metode pokok yaitu dilusi atau difusi. Penting sekali
menggunakan metode standar untuk mengendalikan semua faktor yang mempengaruhi aktivitas antimikroba.
a. Metode Dilusi
Metode ini menggunakan antimikroba dengan kadar yang menurun secara bertahap, baik dengan media cair atau padat. Kemudian media diinokulasi bakteri uji
dan dieramkan. Tahap akhir dilarutkan antimikroba dengan kadar yang menghambat
Universitas Sumatera Utara
atau mematikan. Uji kepekaan cara dilusi agar memakan waktu dan penggunaannya dibatasi pada keadaan tertentu saja Jawetz et al, 2001.
b. Metode Difusi
Metode yang paling sering digunakan adalah metode difusi agar. Cakram kertas saring berisi sejumlah tertentu obat ditempatkan pada permukaan medium
padat yang sebelumnya telah diinokulasi bakteri uji pada permukaannya. Setelah inkubasi, diameter zona hambatan sekitar cakram dipergunakan mengukur kekuatan
hambatan obat terhadap organisme uji. Metode ini dipengaruhi oleh beberapa faktor fisik dan kimia, selain faktor antara obat dan organisme misalnya sifat medium dan
kemampuan difusi, ukuran molekular dan stabilitas obat. Meskipun demikian, standarisasi faktor-faktor tersebut memungkinkan melakukan uji kepekaan dengan
baik Jawetz et al, 2001.
2.4.6 Bakteri Escherichia coli
Berikut sistematika bakteri Escherichia coli Dwidjoseputro, 1998: Divisi
: Bacteriophyta Kelas
: Bacteria Bangsa
: Eubacteriales Suku
: Bacteriaceae Genus
: Escherichia Spesies
: Escherichia coli
Escherichia coli merupakan bakteri gram negatif, berbentuk batang dengan panjang sekitar 2 mikrometer dan diamater 0,5 mikrometer, bersifat anaerob
fakultatif, biasanya dapat bergerak dan tidak membentuk spora. Bakteri ini umumnya hidup pada rentang 20-40
C, optimum pada 37 C.
Universitas Sumatera Utara
Escherichia coli merupakan bakteri yang secara normal terdapat di dalam usus dan berperan dalam proses pembusukan sisa-sisa makanan. Keberadaan bakteri
ini merupakan parameter ada tidaknya materi fekal di dalam suatu habitat khususnya air. Escherichia coli adalah salah satu jenis bakteri yang ada dalam tinja manusia dan
dapat mengakibatkan gangguan pencernaan seperti diare Anonim, 2008.
2.4.7 Bakteri Shigella dysenteriae
Berikut sistematika bakteri Shigella dysenteriae Dwidjoseputro, 1998: Divisi
: Bacteriophyta Kelas
: Bacteria Bangsa
: Eubacteriales Suku
: Bacteriaceae Genus
: Shigella Spesies
: Shigella dysenteriae Shigella dysenteriae merupakan bakteri gram negatif, fakultatif anaerobik,
berbentuk batang yang tidak bergerak, tidak membentuk spora. Bakteri ini berukuran sekitar 0,5-0,7 mikrometer dan tumbuh baik pada suhu 37
C Anonim, 2007. Bakteri ini dapat menyebabkan disentri basiler. Disentri adalah salah satu dari
berbagai gangguan pencernaan yang ditandai dengan peradangan usus terutama kolon, disertai nyeri perut dan buang air besar yang sering mengandung darah dan
lendir Pelczar et al, 1988.
2.4.8 Bakteri Salmonella typhimurium
Berikut sistematika bakteri Salmonella typhimurium Dwidjoseputro, 1998: Divisi
: Bacteriophyta Kelas
: Bacteria
Universitas Sumatera Utara
Bangsa : Eubacteriales
Suku : Bacteriaceae
Genus : Salmonella
Spesies : Salmonella typhimurium
Bentuk tubuh dari Salmonella typhimurium adalah batang lurus pendek dengan panjang 1-1,5 mikrometer. Tidak membentuk spora, bersifat gram negatif.
Biasanya bergerak motil dengan menggunakan flagella dan kadang menjadi bentuk non-motilnya. Bakteri ini tumbuh baik pada suhu optimum sekitar 37
C. Biasanya memproduksi asam dan gas dari glukosa, maltosa, mannitol dan sorbitol, tetapi tidak
memfermentasi laktosa dan sukrosa. Tidak membentuk indol dan gelatin cair. Salmonella typhimurium dapat menyebabkan penyakit tifus yang ditandai dengan
demam, mual, muntah, diare dan hilangnya nafsu makan Anonim, 2008.
Universitas Sumatera Utara
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan November 2009-Januari 2010 di laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara dan
laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Fakultas MIPA Universitas Sumatera Utara Medan.
3.2 Metode Penelitian
Penelitian dilakukan dengan metode eksperimental meliputi pengumpulan dan pengolahan sampel, pemeriksaan karakterisasi simplisia, pembuatan ekstrak dan
uji aktivitas antibakteri dari ekstrak kulit buah jengkol terhadap bakteri Escherichia coli, Shigella dysenteriae dan Salmonella typhimurium.
3.3 Alat dan Bahan 3.3.1 Alat
Seperangkat alat perkolator, neraca kasar Ohaus, neraca listrik Mettler Toledo, rotary evaporator, freeze dryer, alat destilasi, alat-alat gelas, aluminium
foil, pipet serologi, eksikator Fischer Scientific, krus porselin, mikroskop Olympus, objek glass, deck glass, oven listrik Fischer Scientific, penangas air,
tanur Ney M 525 Series II, blender National, autoklaf Webeco, cawan petri, inkubator Fischer Scientific, spatula, lemari pendingin Toshiba, lemari
pengering, lampu spiritus, jarum ose, pH indikator, pinset, hot plate Fisons, lampu bunsen, kertas cakram, jangka sorong.
Universitas Sumatera Utara
3.3.2 Bahan
Bahan yang digunakan adalah kulit buah dari tanaman jengkol Pithecellobium lobatum Benth, air suling, larutan fisiologis NaCl 0,9 steril,
etanol 96, etanol 70, toluena, larutan kloralhidrat, kloroform, HCl 2 N, larutan kristal violet, larutan aceton-alkohol, larutan safranin, larutan iodine, Nutrient Agar
NA, Mueller Hinton Agar MHA, Media Mac. Conkey, Salmonella Shigella Agar SSA, glukosa, maltosa, laktosa, NaOH 0,2 N, bakteri Escherichia coli ATCC
25922, Shigella dysenteriae, Salmonella typhimurium.
3.4 Pembuatan Media dan Pereaksi 3.4.1 Nutrient Agar NA
Komposisi: Beef extract
3,0 gram Pepton
5,0 gram Agar
15,0 gram Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 23 gram serbuk nutrient agar kemudian
disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml, dipanaskan sebentar sambil sekali-kali diaduk sampai
terbentuk larutan jernih. Tutup erlenmeyer dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 2 atm selama 15 menit.
3.4.2 Mueller Hinton Agar MHA
Komposisi: Beef infusion form
300 g Casein hydrolysate
17,5 g Starch
1,5 g Agar
17 g
Universitas Sumatera Utara
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 38 gram serbuk MHA kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga
1000 ml, dipanaskan hingga mendidih sambil sekali-kali diaduk sampai terbentuk larutan jernih. Tutup erlenmeyer dengan kapas yang dilapisi aluminium foil.
Disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 2 atm selama 15 menit.
3.4.3 Media Mac. Conkey
Komposisi: Peptone
20,0 gram Lactose
20,0 gram Bile Salt
5,0 gram Sodium chloride
5,0 gram Agar
12,0 gram Phenol red
0,075 gram Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 52 gram bahan, kemudian disuspensikan
dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga 1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sekali- kali diaduk sampai seluruhnya larut
sempurna. Tutup erlenmeyer dengan kapas yang dilapisi aluminium foil. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
C dan tekanan 2 atm selama 15 menit.
3.4.4 Salmonella Shigella Agar SSA
Komposisi: Lab-Lemco powder 5,0 gram
Peptone 5,0 gram
d-glucose 10,0 gram
Bile Salt 8,5 gram
Sodium citrate 10,0 gram
Sodium thiosulfate 8,5 gram
Universitas Sumatera Utara
Ferric citrate 1,0 gram
Briliant green 0,00033 gram
Neutral red 0,025 gram
Bacto agar 13,5 gram
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 60 gram serbuk SSA, kemudian disuspensikan dalam erlenmeyer dengan air suling yang ditambahkan sedikit demi sedikit hingga
1000 ml. Dipanaskan sebentar sambil sesekali diaduk sampai seluruhnya larut sempurna. Selagi masih panas segera tuang ke dalam cawan petri steril sambil
meminimalisasi terjadinya kontaminasi, disimpan dalam lemari es. 3.4.5 Media Cair Glukosa
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 10 gram glukosa, dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml. Bila pH 7 maka ditambahkan beberapa tetes NaOH 0,2 N.
3.4.6 Media Cair Maltosa
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 10 gram maltosa, dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml. Bila pH 7 maka ditambahkan beberapa tetes NaOH 0,2 N.
3.4.7 Media Cair Laktosa
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 10 gram laktosa, dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml. Bila pH 7 maka ditambahkan beberapa tetes NaOH 0,2 N.
3.4.8 Larutan NaOH 0,2 N
Cara pembuatan: larutkan 8,001 g NaOH p dalam air suling secukupnya hingga 1000 ml Depkes RI, 1979.
3.4.9 Larutan NaCl 0,9
Universitas Sumatera Utara
Cara pembuatan: ditimbang 0,9 gram NaCl kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 2 atm selama 15 menit Depkes RI, 1979.
3.4.10 Larutan Standar Mc Farland 0,5
Komposisi: BaCl
2
1,175 bv 0,5 ml
H
2
SO
4
1 vv 99,5 ml
Cara pembuatan: campurkan kedua larutan dan diaduk hingga homogen Vandepitte et al, 1991.
3.4.11 Pereaksi Asam Klorida 2 N
Asam klorida pekat sebanyak 17 ml diencerkan dengan air suling hingga 100 ml Depkes RI, 1979.
3.4.12 Kloralhidrat
Dilarutkan 50 gram kloralhidrat dalam 20 ml air suling Depkes RI, 1979.
3.4.13 Larutan Kristal violet
Komposisi: Gentian violet
5 gram Alkohol 96 hingga 100 ml
Fenol 5 gram
Air suling hingga 100 ml
Cara pembuatan: ditimbang sebanyak 5 gram gentian violet, kemudian dalam erlenmeyer bertutup dilarutkan bahan dengan alkohol 96 hingga 100 ml.
Ditimbang 5 gram fenol dan dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml. Dicampurkan 10 ml larutan gentian violet dan 90 ml larutan fenol, dikocok hingga
homogen. Untuk pemakaian sebaiknya baru dicampurkan Hadioetomo, R, 2000.
3.4.14 Larutan Aceton-Alkohol
Universitas Sumatera Utara
Komposisi: Alkohol 96
250 ml Aceton
250 ml Cara pembuatan: dicampurkan alkohol 96 dan aceton, dikocok hingga homogen
Hadioetomo, R, 2000.
3.4.15 Larutan Safranin
Komposisi: Safranin
0,25 gram Alkohol 96
10 ml Air suling hingga
100 ml Cara pembuatan: ditimbang 0,25 gram safranin, kemudian dilarutkan dalam alkohol
96 lalu ditambahkan air suling hingga 100 ml Hadioetomo, R, 2000.
3.4.16 Larutan Iodine
Komposisi: Iodium
1 gram Kalium iodida
2 gram Air suling hingga
100 ml Cara pembuatan: ditimbang 2 gram kalium iodida, kemudian dilarutkan dengan
sebagian air suling. Ditimbang iodium sebanyak 1 gram dan dilarutkan sedikit demi sedikit ke dalam larutan kalium iodida, diaduk hingga larut sempurna kemudian
diencerkan dengan sisa air suling hingga 100 ml. Larutan disimpan dalam wadah berwarna gelap Cappuccino, JG and Sherman, N, 1987.
3.5 Penyiapan Sampel 3.5.1 Pengumpulan Sampel
Pengumpulan sampel dilakukan secara purposif, yaitu tanpa membandingkannya dengan sampel dari daerah lain. Bagian sampel yang digunakan
dalam penelitian adalah kulit buah dari tanaman jengkol Pithecellobium lobatum
Universitas Sumatera Utara
Benth yang diambil dari salah satu pedagang jengkol di wilayah pasar Petisah Medan.
3.5.2 Identifikasi Sampel
Identifikasi sampel dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Departemen Biologi Fakultas MIPA Universitas Sumatera Utara Medan.
3.5.3 Pengolahan Sampel
Kulit buah jengkol yang telah dikumpulkan dibersihkan dari pengotoran dengan menggunakan air bersih yang mengalir, kemudian ditiriskan. Selanjutnya
dibuang bagian yang tidak diperlukan sortasi basah, kemudian ditimbang berat basahnya. Kulit buah jengkol selanjutnya diiris tipis-tipis dan dikeringkan di dalam
lemari pengering sampai kering, lalu ditimbang berat kering simplisia. Selanjutnya simplisia diserbuk hingga halus menggunakan blender dan diayak. Disimpan dalam
wadah plastik yang tertutup rapat.
3.6 Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia
Dilakukan pemeriksaan karakterisasi simplisia yang meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut
dalam air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total dan penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam Ditjen POM, 1989.
3.6.1 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan terhadap tumbuhan segar dan simplisia meliputi bentuk, bau, warna dan rasa.
3.6.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan ini dilakukan terhadap irisan melintang dari kulit buah jengkol segar dan serbuk simplisia. Pemeriksaan mikroskopik untuk irisan melintang
Universitas Sumatera Utara
tumbuhan segar dilakukan sebagai berikut: dibuat irisan melintang kulit buah jengkol. Hasil irisan tipis diletakkan di atas objek gelas lalu ditetesi larutan
kloralhidrat, dipanaskan dengan lampu spiritus, ditutup dengan kaca penutup dan dilihat di bawah mikroskop pada berbagai perbesaran.
Pemeriksaan mikroskopik untuk serbuk simplisia dilakukan sebagai berikut: sejumlah serbuk simplisia diletakkan merata di atas objek gelas lalu ditetesi larutan
kloralhidrat, ditutup dengan kaca penutup dan dilihat di bawah mikroskop pada berbagai perbesaran.
3.6.3 Penetapan Kadar Air
Ke dalam labu alas bulat di masukkan 200 ml toluena dan 2 ml air suling, destilasi selama 2 jam, biarkan menjadi dingin selama 30 menit dan volume air
dalam tabung penampung dibaca. Selanjutnya ke dalam labu dimasukkan 5 gram serbuk simplisia lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluena
mendidih, kecepatan tetesan diatur yaitu 2 tetesan per detik sampai sebagian air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes per detik. Setelah
semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penampung dibiarkan dingin sampai
sama dengan suhu kamar. Setelah air dan toluena memisah sempurna, dibaca volume air dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan
kandungan air di dalam bahan yang diperiksa WHO, 1992.
3.6.4 Penetapan Kadar Sari yang larut dalam air
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml campuran air dan kloroform 2,5 ml kloroform dalam
air sampai 1000 ml dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam
Universitas Sumatera Utara
pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Disaring, sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata dan telah ditara, sisanya
dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Ditjen POM, 1989.
3.6.5 Penetapan Kadar Sari yang larut dalam etanol
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok
sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring, 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata
yang telah ditara dan sisanya dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara
Ditjen POM, 1989.
3.6.6 Penetapan Kadar Abu Total
Sebanyak 2 gram serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan.
Krus dipijar pada suhu 600
o
C sampai arang habis. Selanjutnya didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang
telah dikeringkan di udara WHO, 1992.
3.6.7 Penetapan Kadar Abu yang tidak larut dalam asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida 2 N selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu dan dicuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijar pada suhu 600
o
C sampai bobot tetap, kemudian
Universitas Sumatera Utara
didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan WHO,1992.
3.7 Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak dilakukan secara perkolasi menggunakan pelarut etanol 96. Cara kerja: sebanyak 730 gram serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana
tertutup, tuangi cairan penyari sampai semua simplisia terendam sempurna dan dibiarkan sekurang-kurangnya selama 3 jam. Pindahkan massa sedikit demi sedikit
ke dalam perkolator sambil tiap kali ditekan hati-hati, tuangi cairan penyari secukupnya sampai cairan mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis
cairan penyari, tutup perkolator dan biarkan selama 24 jam. Biarkan cairan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit, ditambahkan berulang-ulang cairan penyari
secukupnya hingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia. Perkolasi dihentikan hingga bila 500 mg perkolat yang keluar terakhir diuapkan tidak
meninggalkan sisa. Perkolat yang diperoleh dipekatkan dengan alat penguap rotary evaporator dan dikering bekukan dengan freeze dryer Depkes RI, 1979.
3.8 Uji Aktivitas Antibakteri 3.8.1 Sterilisasi Alat
Kategori