3 METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret sampai Mei 2011 di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku Hasil Perairan, Laboratorium
Mikrobiologi Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan; Laboratorium Imunologi, Fakultas Kedokteran
Hewan; Laboratorium Pilot Plant, Pusat Antar Universitas PAU; Laboratorium Terpadu, Institut Pertanian Bogor.
3.2 Bahan dan Alat Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari bahan utama berupa ikan lele dumbo 1 kg = ± 5 ekor, enzim papain dan akuades,
bahan-bahan kimia untuk assay aktivitas enzim papain kasein 2 bv, tirosin, CaCl
2
, Na
2
CO
3
, folin 50 vv, akuades, TCA 5 bv dan larutan buffer fosfat pH 7,5; konsentrasi protein enzim papain bovine serum albumin BSA,
etanol 96 vv, coomassie briliant blue G-250, asam fosfat 85 bv dan akuades; analisis proksimat K
2
SO
4
, CuSO
4
, H
2
SO
4
, bromocresol green, methyl red, NaOH 40 bv, H
3
BO
3
4 vv dan HCl; analisis asam amino Ortoftalaldehida OPA, buffer borat 1 M, HCl 6 N, gas N
2
, Na-Asetat 0,025 M, Na-EDTA, metanol 95 vv, THF, merkaptoetanol, Brij-30 larutan standar
asam amino 0,5 µ molml; analisis derajat hidrolisis TCA 20 bv; analisis daya cerna protein in vitro HCl, enzim pepsin, NaOH, enzim pankreatin,
natrium azida, buffer fosfat pH 8,0. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain timbangan
analitik Sartorius, refrigerator LG, homogenizer Nissei AM-3, waterbath shaker Wiggen Hauser, spray dryer Buchi, sentrifuge Sorvall T-21,
oven Yamato, pH meter Orion, inkubator Termolina, mikropipet Pipetman, spektrofotometer Yamato dan High Performance Liquid Chromatography
Shimadzu.
3.3 Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam empat tahap, meliputi pembuatan hidrolisat protein ikan; penentuan konsentrasi optimum enzim papain; penentuan waktu
hidrolisis optimum dan karakterisasi hidrolisat protein ikan lele dumbo yang dihasilkan.
3.3.1 Pembuatan hidrolisat protein ikan Pembuatan hidrolisat protein ikan dilakukan melalui reaksi hidrolisis
enzimatis menggunakan enzim papain. Metode pembuatan hidrolisat protein ikan yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode Nurhayati et al. 2007
yang telah dimodifikasi. Ikan lele dumbo dimatikan dengan cara ditusuk bagian medula oblongatanya. Ikan lele dumbo yang telah mati selanjutnya disiangi
dan di-fillet skinless, kemudian dicincang. Daging ikan cincang dihomogenisasi dengan akuades dalam perbandingan 1:4 1 bagian daging ikan cincang dicampur
dengan 4 bagian akuades menggunakan homogenizer selama 2 menit. Nilai pH campuran diatur hingga mencapai pH optimal enzim papain, yaitu pH 7,0 dengan
menambahkan larutan NaOH 1 M dan atau larutan HCl 1 M. Campuran daging ikan cincang dengan akuades tersebut ditambahkan enzim papain dengan
konsentrasi tertentu konsentrasi optimum enzim papain. Hidrolisis dilakukan pada suhu 55 °C menggunakan water bath shaker selama waktu tertentu waktu
hidrolisis optimum. Setelah proses hidrolisis selesai, enzim papain diinaktivasi pada suhu
80 °C selama 20 menit dengan tujuan untuk menghentikan proses hidrolisis. Sampel disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 20 menit, suhu 4 °C untuk
memisahkan fraksi terlarut supernatan dan fraksi yang tidak terlarut pellet. Supernatan dikeringkan menggunakan pengering semprot spray dryer dengan
suhu inlet sebesar 160 °C dan suhu outlet sebesar 80 °C. Serbuk hidrolisat protein yang dihasilkan disimpan dalam wadah tertutup. Diagram alir proses pembuatan
hidrolisat protein ikan dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4 Diagram alir proses pembuatan hidrolisat protein ikan Nurhayati et al. 2007 yang telah dimodifikasi Keterangan:
=
Mulai dan akhir proses;
=
Proses; = Modifikasi.
Ikan Lele Dumbo
Penyiangan
Pencincangan Homogenisasi dengan akuades 1: 4
Penambahan enzim papain Hidrolisis
suhu 55 °C; pH 7,0; waktu tertentu Inaktivasi enzim
suhu 80 °C; selama 20 menit
Spray drying Sentrifugasi
Padatan
Filtrat
Hidrolisat protein ikan Pembuatan fillet skinless
3.3.2 Penentuan konsentrasi optimum enzim papain Tahap ini bertujuan untuk menentukan konsentrasi optimum enzim papain
terhadap substrat yang digunakan dalam hidrolisis enzimatis protein ikan lele dumbo. Konsentrasi enzim papain yang digunakan yaitu 0 bv tanpa
penambahan enzimkontrol; 1 bv; 2 bv; 3 bv; 4 bv; 5 bv dan 6 bv. Hidrolisis dilakukan selama 6 jam pada suhu 55 °C dan nilai pH
sebesar 7,0. Penentuan kisaran konsentrasi enzim ini berdasarkan pada penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Nurhayati et al. 2007 pada ikan selar yang
menunjukkan bahwa konsentrasi optimum enzim papain untuk menghidrolisis protein ikan selar adalah 5 bv. Konsentrasi optimum enzim papain ditentukan
dengan menghitung perbandingan nitrogen total terlarut dan nitrogen total bahan NTTNTB.
3.3.3 Penentuan waktu hidrolisis optimum Tahap ini bertujuan untuk menentukan waktu hidrolisis optimum yang
digunakan dalam hidrolisis enzimatis protein ikan lele dumbo dengan enzim papain. Waktu hidrolisis yang digunakan yaitu 0 jam , 1 jam, 2 jam, 3 jam, 4 jam,
5 jam, 6 jam dan 7 jam. Enzim papain yang ditambahkan sesuai dengan hasil penentuan konsentrasi optimum enzim papain. Proses hidrolisis berlangsung pada
suhu 55 °C dan nilai pH sebesar 7,0. Waktu hidrolisis optimum ditentukan dengan menghitung perbandingan nitrogen total terlarut dan nitrogen total bahan
NTTNTB. 3.3.4 Karakterisasi hidrolisat protein ikan lele dumbo
Karakterisasi dilakukan terhadap hidrolisat protein ikan lele dumbo yang dihasilkan dari reaksi hidrolisis enzimatis pada kondisi optimum. Analisis yang
dilakukan, yaitu analisis proksimat, asam amino dan daya cerna protein in vitro .
3.4 Prosedur Analisis
