Diagnosis Ex juvantibus Kerangka Konsepsional Jenis dan Rancangan Penelitian Kerangka Operasional Instrumen Penelitian

untuk kelas protein ini. HSP 65 kD memainkan peran ganda dalam sel, terutama sebagai molecular chaperones dan juga sebagai antigen immunodominant pada infeksi host. Satu penelitian menunjukkan bahwa level protein MT ini meningkat hingga 1-10 di bawah kondisi stres yang kemungkinan akan terjadi selama infeksi TB. 33 Penelitian lain yang dilakukan oleh Dan McWilliam et al., menyimpulkan bahwa ab905 muncul untuk mengikat antigen manusia pada sinovium yang meradang, dengan hipotesisnya bahwa ab905 merupakan heat- shock protein. 33

2.11. Diagnosis Ex juvantibus

Istilah ex juvantivus dari bahasa Latin berarti “dari apa yang membantu” adalah proses membuat kesimpulan tentang penyebab penyakit berdasarkan respons penyakit tersebut terhadap pengobatan. 34 Pemakaian istilah ex juvantibus ini tidak perlu dianggap salah. Misalnya, seorang yang menderita sakit pada retrosternal, yang tidak sembuh dengan pemberian nitrate sublingual obat standar untuk angina pektoris, tapi hilang sakitnya dengan pemberian antasida obat standar untuk heartburn. Pada kasus demikian, dokter dapat memikirkan diagnosis ex juvantibus terhadap masalah yang dihadapi tersebut. 34 Universitas Sumatera Utara

2.12. Kerangka Konsepsional

Limfadenitis TB Histiosit - histiosit epiteloid, multinucleated giant cells dari tipe foreign body atau Langhans type giant cells Limfadenitis suspek TB Badan-badan kecil berbentuk oval gelap di dalam kelompokan makrofag dan bercak-bercak gelap dengan massa amorf bergranula halus eosinofilik Mycobacterium tuberculosis ab905 Limfadenitis TB Gambar 2.8. Skema Kerangka Konsepsional Universitas Sumatera Utara BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian analitik dengan rancangan cross sectional. 3.2. Tempat dan Waktu Penelitian 3.2.1. Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan di Sentra Diagnostik Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara bekerja sama dengan Laboratorium Patologi Anatomi RSUP H. Adam Malik dan praktek dokter spesialis Patologi Anatomi swasta di Medan.

3.2.2. Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan selama bulan Desember 2009 sampai September 2010 yang meliputi studi kepustakaan, pengumpulan data, pengumpulan sampel, penelitian dan penulisan. Universitas Sumatera Utara

3.3. Kerangka Operasional

Massa pada kelenjar getah bening Kriteria inklusi Aspirasi biopsi jarum halus Limfadenitis suspekTB Limfadenitis non spesifik Aspirasi biopsi jarum halus ulang Imunositokimia ab905 Badan-badan kecil berbentuk oval gelap di dalam kelompokan beberapa makrofag Bercak-bercak gelap Radang kronik Abses Tampilan antigen M. tuberkulosis Kriteria eksklusi Gambar 3.1. Skema Kerangka Operasional Universitas Sumatera Utara 3.4. Populasi, Sampel dan Besar Sampel Penelitian 3.4.1. Populasi Populasi target adalah penderita pembengkakan kelenjar getah bening di lokasi manapun pada tubuh yang akan didiagnosis sebagai limfadenitis TB. Populasi terjangkau adalah penderita pembengkakan kelenjar getah bening di lokasi manapun pada tubuh yang akan didiagnosis sebagai limfadenitis TB yang datang berobat ke Sentra Diagnostik Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Laboratorium Patologi Anatomi RSUP H. Adam Malik dan praktek swasta di Medan.

3.4.2. Sampel

Sampel adalah penderita pembengkakan kelenjar getah bening di lokasi manapun pada tubuh yang memenuhi kriteria inklusi dan sesuai besar sampel penelitian. Cara pemilihan sampel adalah non probability consecutive sampling dimana semua subyek yang datang dan memenuhi kriteria pemilihan dimasukkan dalam penelitian sampai jumlah subyek yang diperlukan terpenuhi. Universitas Sumatera Utara

3.4.3. Besar Sampel Penelitian

Sejauh ini peneliti belum menemukan publikasi data-data penelitian mengenai jumlah penderita suspek TB dengan gambaran sitologi berupa badan- badan kecil berbentuk oval berwarna gelap di dalam kelompokan beberapa makrofag dan bercak-bercak gelap dengan massa amorf bergranula halus eosinofilik pada latar belakangnya, di Indonesia bahkan pada literatur internasional sekalipun. Oleh karena itu peneliti menggunakan nilai P proporsi = 0,50. Tingkat kemaknaan yang dipergunakan pada penelitian ini adalah 0,05 dengan interval kepercayaan 95. Dari tabel didapat Z α = 1,96. Tingkat kesalahan adalah 10. Jumlah sampel dihitung dengan rumus : n = z α 2 . PQ d 2 Keterangan : n = besar sampel P = proporsi penelitian Q = 100 - p α = tingkat kemaknaan d = tingkat kesalahan Universitas Sumatera Utara Sehingga : n = 1,96 2 0,50 0,50 0,10 2 = 97 Jumlah sampel yang digunakan pada penelitian ini mencakup penderita dengan gambaran sitologi berupa badan-badan kecil berbentuk oval berwarna gelap di dalam kelompokan beberapa makrofag, bercak-bercak gelap dengan massa amorf bergranula halus eosinofilik pada latar belakangnya, radang kronik non spesifik dan abses sebanyak 97 sampel. 3.5. Kriteria Inklusi dan Eksklusi 3.5.1. Kriteria Inklusi 1. Penderita yang didiagnosis secara mikroskopik dengan adanya badan-badan kecil berbentuk oval berwarna gelap di dalam kelompokan beberapa makrofag, laki-laki maupun perempuan dan tanpa batasan umur. 2. Penderita yang didiagnosis secara mikroskopik dengan adanya bercak- bercak gelap dengan massa amorf bergranula halus eosinofilik pada latar belakangnya, laki-laki maupun perempuan dan tanpa batasan umur. 3. Penderita yang didiagnosis secara mikroskopik sebagai radang kronik non spesifik, laki-laki maupun perempuan dan tanpa batasan umur. Universitas Sumatera Utara 4. Penderita yang didiagnosis secara mikroskopik sebagai abses, laki-laki maupun perempuan dan tanpa batasan umur. Seluruh penderita dengan diagnosis limfadenitis suspek TB kriteria 1 dan 2 bersedia diberikan terapi anti tuberkulosis. 5. Bersedia untuk mengikuti program penelitian ini sampai selesai, yang dinyatakan secara tertulis setelah mendapat penjelasan mengenai penelitian ini informed consent.

3.5.2. Kriteria Eksklusi

1. Penderita dengan gambaran morfologi secara sitologi dijumpai histiosit- histiosit epiteloid pada latar belakang limfosit, multinucleated giant cells dari tipe foreign body atau Langhans type giant cells dan dapat atau tidak menunjukkan adanya nekrosis. 2. Penderita limfoma, HIV positif, metastasis malignan dan diabetes melitus. 3. Penderita yang sebelumnya telah mendapat pengobatan anti tuberkulosis dan kortikosteroid. 4. Penderita yang setelah didiagnosis limfadenitis suspek TB tidak bersedia diberikan terapi anti tuberkulosis. 5. Penderita-penderita dengan slide-slidenya yang telah dipulas dengan antibodi ab905 tidak menunjukkan jaringan limfoid. Universitas Sumatera Utara

3.6. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

3.6.1. Variabel Penelitian

Variabel yang menjadi perhatian di dalam penelitian ini yaitu :  Variabel bebas adalah badan-badan kecil berbentuk oval berwarna gelap di dalam kelompokan beberapa makrofag, bercak-bercak gelap dengan massa amorf eosinofilik, radang kronik non spesifik dan abses.  Variabel terikat adalah limfadenitis tuberkulosis.

3.6.2. Definisi Operasional

 Limfadenitis suspek TB berupa gambaran badan-badan kecil berbentuk oval berwarna gelap di dalam kelompokan makrofag dan bercak-bercak gelap dengan massa amorf bergranula halus eosinofilik merupakan dua struktur yang dijumpai pada sediaan aspirat kelenjar getah bening yang tidak spesifik sebagai tuberkulosis akan tetapi respons terhadap pengobatan anti tuberkulosis. Universitas Sumatera Utara Gambar 3.2. Badan-badan kecil berbentuk oval berwarna gelap di dalam kelompokan beberapa makrofag MGG, 400x Gambar 3.3. Aspirat dengan bercak-bercak gelap dengan massa amorf bergranula halus eosinofilik pada latar belakangnya MGG,400x Universitas Sumatera Utara  Limfadenitis non spesifik berupa radang kronik non spesifik dan abses.  Radang kronik non spesifik dengan gambaran morfologi sitologi terdiri dari sel-sel radang limfosit, fibroblast dengan atau tanpa adanya nekrotik, tidak spesifik untuk tuberkulosis dan respons terhadap antibiotika biasa.  Abses dengan gambaran morfologi sitologi terdiri dari sel-sel radang PMN, tidak spesifik untuk tuberkulosis dan respons terhadap antibiotika biasa. Gambar 3.4. Aspirat tanpa bercak-bercak gelap MGG, 400x  Tuberkulosis dengan gambaran morfologi sitologi terdiri dari: histiosit- histiosit epiteloid pada latar belakang limfosit, multinucleated giant cells dari tipe foreign body atau Langhans type giant cells dan dapat atau tidak menunjukkan adanya nekrosis. Universitas Sumatera Utara  Pemeriksaan imunositokomia merupakan suatu teknik pemeriksaan untuk mengidentifikasi selular atau jaringan yang mengandung antigen dengan melihat interaksi antigen-antibodi, pengikatan antibodi yang diidentifikasi dengan pemberian antibodi secara langsung dengan atau tanpa menggunakan antibodi sekunder.  Mycobacterium tuberculosis antibody ab905 adalah heat-shock protein yang merupakan sekelompok protein dimana ekspresinya meningkat bila sel-sel terpapar dengan temperatur tinggi.  Hasil pulasan imunositokimia ab905 adalah tampilan antigen kumpulan basil M. tuberculosis warna coklat pada kelompokan makrofag dan pada bercak-bercak gelap dengan massa nekrotik eosinofilik.  Diagnosis ex juvantibus adalah proses membuat kesimpulan tentang penyebab penyakit berdasarkan respons penyakit tersebut terhadap pengobatan.  Hasil positif + apabila terdapat tampilan pulasan warna coklat pada kelompokan makrofag dan massa nekrotik eosinofilik.  Hasil negatif - apabila tidak berhasil menampilkan warna coklat pada kelompokan makrofag dan massa nekrotik eosinofilik, dimana pada saat yang sama kontrol + menampilkan warna coklat dengan pewarnaan kromogen DAB. Universitas Sumatera Utara

3.7. Prosedur Penelitian

3.7.1. Pengambilan Sampel Sitologi

Peralatan dan lokasi pengambilan sampel sitologi Peralatan yang digunakan adalah pistolet Comeco Swedia, spuit disposible 10ml, ukuran jarum 22–23G, panjang 30–50mm, kapas alkohol dan lokasi pengambilan pada lymph node leher dan pembengkakan lain di lokasi manapun pada tubuh.

3.7.1.1. Prosedur Pengambilan Sediaan Sitologi

1. Kulit didesinfeksi, tanpa menggunakan anestesi, nodul atau tumor difiksasi diantara jari tangan, sambil kulit di atasnya diregangkan. Pada posisi piston tabung suntik di bagian distal, jarum diinsersi ke dalam massa tumor. 2. Piston semprit cepat ditarik dan tekanan negatif akan menyebabkan materi tertarik ke dalam jarum. 3. Jarum digerakkan dengan cepat ke muka dan ke belakang supaya materi cukup terisap. 4. Supaya jarum ditarik dari lesi, tekanan dalam semprit harus dibuat sama dengan tekanan di luar semprit membiarkanmelepaskan piston kembali sendirinya pada posisi terdahulu. 5. Semprit dengan jarum ditarik dari lesi. Universitas Sumatera Utara 6. Jarum dilepaskan dari semprit, piston ditempatkan pada bagian tengah semprit. 7. Jarum kembali diletakkan pada semprit dan aspirat yang ada di dalam ujung jarum disemprotditeteskan ke atas kaca objek dengan menekan piston.

3.7.1.2. Prosedur Pewarnaan Sitologi dengan Diff-Quik Stain Set

1. Celupkan sediaan ke dalam larutan fiksatif selama 5 detik 5 kali celup masing-masing satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir. 2. Celupkan sediaan ke dalam larutan I selama 5 detik 5 kali celup masing- masing satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir. 3. Celupkan sediaan ke dalam larutan II selama 5 detik 5 kali celup masing- masing satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir. 4. Cuci sediaan dengan air destilasi atau air diionisasi. 5. Keringkan dan siap untuk dibaca.

3.7.2. Prosedur Kerja Imunositokimia Mycobacterium Tuberculosis Antibody

p ab905 pada Sediaan Hapus 1. Buat sediaan hapus, fiksasi dalam metanol absolut. 2. Cuci dalam air mengalir selama 5 menit. Universitas Sumatera Utara 3. Bloking endogen peroksida metanol + H2O2 selama 30 menit. 4. Cuci dalam air mengalir selama 5 menit. 5. Pretreatment dengan Working Citrate Solution pada microwave: - Cook I, power level high selama 5 menit - Cook II, power level warm selama 5 menit Dinginkan selama lebih kurang 45 menit 6. Cuci dalam PBS pH 7,4 sebanyak 3x, masing-masing selama 5 menit. 7. Tandai populasi sel dengan Pap pen. 8. Teteskan antibodi primer, diamkan selama 1 jam. 9. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit atau sampel bersih. 10. Teteskan Envision plus, diamkan selama 30 - 45 menit. 11. Cuci dengan PBS pH 7,4 + Twin 20 selama 5 menit atau sampai bersih. 12. Teteskan kromogen DAB, diamkan selama 10 menit. 13. Cuci dengan air mengalir selama 5 menit. 14. Counterstain dengan Hematoxylin Mayers selama 5–10 menit. 15. Cuci dengan air mengalir selama 5 menit. 16. Masukkan ke dalam larutan litium karbonat jenih 5 dalam akuades. 17. Birukan dalam air mengalir. 18. Dehidrasi alkohol 80, alkohol 96, alkohol absolut masing-masing selama 5 menit. 19. Clearing xylol I, xylol II, xylol III masing-masing selama 5 menit. Universitas Sumatera Utara 20. Mounting, tutup dengan entelan. 21. Sediaan siap untuk dibaca. 3.8. Alat-alat Penelitian dan Bahan Penelitian 3.8.1. Alat-alat Penelitian Alat- alat yang diperlukan untuk penelitian ini adalah staining jar, rak object glass, rak inkubasi, pap pen, pipet mikro, timbangan bahan kimia, kertas saring, pengukur waktu, gelas Erlenmeyer, gelas beker, tabung sentrifuge 15 ml, microwave, spin master, object glass, kaca penutup, entelan dan mikroskop cahaya.

3.8.2. Bahan Penelitian

 Antibodi primer : rabbit polyclonal to Mycobacterium tuberculosis antibody ab905, Abcam, dengan pengenceran 200x.  Envision + Dual Link system-HRP DAB+ 284 dari DakoCytomation, terdiri dari - 1 x 15 mL : Dual Endogenous Enzyme Block - 1 x 15 mL : Labelled Polymer-HRP Universitas Sumatera Utara - 1 x 18 mL : DAB + Substrat Buffer - 1 x 1 mL : DAB + Chromogen  Larutan PBS pH 7,4 Natrium klorida NaCl : 80 gram Kalium klorida : 2 gram Na2HPO4 : 11 gram KH2PO4 : 2 gram Add aqua dest : 1 liter  Larutan litium karbonas 50 gram litium karbonas add akuades 1000 ml LarutanTris HCL buffer 0,05 M pH 7,6 NaCl : 8,765 gram Tris : 6,1 gram HCl pekat : 3cc Add aqua dest : 1 liter  Larutan Working Citrate Solution Diambil dari : stock sodium citrate 41ml + stock citric acid 9ml + aqua 450ml. Sitrat Buffer Stock 0,1 M Sodium Citrate Universitas Sumatera Utara Citric citrate : 29,41 gram Add aqua dest : 1 liter Sitrat Buffer Stock 0,1 M Citric Acid Citric acid : 21,01 gram Add aqua dest : 1 liter  Diff-Quik Stain Set Larutan Diff-Quik Stain Larutan fiksatif Triarylmethane dye, 100 PDC Methyl alcohol, dalam konsentrasi 0,002 gliter Larutan I Xanthene dye, 100 PDC Buffer Sodium azide, dalam konsentrasi 1,25 gliter Larutan II Thiazine dye mixture, 100 Buffer, dalam konsentrasi 1,25 gL Universitas Sumatera Utara

3.9. Instrumen Penelitian

Instrumen penelitian yang digunakan adalah hasil pewarnaan imunositokimia ab905 terhadap sampel sediaan sitologi dari kelenjar getah bening di lokasi manapun pada tubuh. Penilaian terhadap pulasan imunositokimia ab905 adalah sebagai berikut :  Kontrol positif : limfadenitis TB yang telah diketahui positif terhadap ab905.  Kontrol negatif : limfadenitis TB dengan antibodi primer yang digantikan dengan serum normal.  Positif : warna coklat yang tertampil pada kelompokan makrofag dan massa nekrotik eosinofilik.  Negatif : tidak berhasil menampilkan warna coklat pada kelompokan makrofag dan massa nekrotik eosinofilik. Universitas Sumatera Utara

3.10. Pengolahan Data