dalam media agar pada suhu 35 ºC selama 48 jam, maka mikroorganisme tersebut akan tumbuh berkembang biak dengan membentuk koloni yang dapat langsung
dihitung BSN 2006
c
. Sampel ditimbang secara aseptik sebanyak 25 gram dan ditambahkan
225 ml larutan b utterfield’s phospate buffered, kemudian dihomogenkan selama 2
menit. Homogenat ini merupakan larutan pengenceran 10
-1
. Dengan menggunakan pipet steril, diambil 1 ml homogenat dan dimasukkan ke dalam botol berisi 9 ml
larutan b utterfield’s phospate buffered sehingga diperoleh contoh dengan
pengenceran 10
-2
. Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali, kemudian dilakukan hal yang sama untuk pengenceran 10
-3
, 10
-4
,
10
-5
,
dan seterusnya sesuai kondisi sampel. Selanjutnya untuk metode cawan tuang pour
plate method , dipipet sebanyak 1 ml dari setiap pengenceran dan dimasukkan ke
dalam cawan petri steril secara duplo menggunakan pipet steril. Ke dalam masing- masing cawan yang sudah berisi sampel, ditambahkan 12-15 ml media Plate
Count Agar PCA yang sudah didinginkan hingga mencapai suhu 45 ºC. Setelah
agar menjadi padat, cawan petri yang telah berisi agar dan larutan sampel tersebut dimasukkan ke dalam inkubator dengan posisi terbalik selama 48 jam pada suhu
35 ºC. Selanjutnya dilakukan pengamatan dengan menghitung jumlah koloni bakteri yang ada di dalam cawan petri menggunakan alat penghitung koloni.
Jumlah koloni yang dihitung adalah cawan petri yang mempunyai koloni bakteri antara 25-250 koloni.
3.5.4 Analisis jumlah bakteri pembentuk histamin modifikasi Niven et al. 1981
Analisis bakteri pembentuk histamin dilakukan untuk mengetahui jenis bakteri yang berperan dalam pembentukan histamin. Prinsip dari analisis bakteri
pembentuk histamin adalah Enterobactericeae akan mengubah histidin menjadi histamin melalui proses dekarboksilasi yang akan menaikkan pH dan mengubah
warna pada media Niven et al. 1981. Media modifikasi Niven agar dipersiapkan dengan cara mencampurkan
0,1 trypton, 0,2 yeast extract, 1,8 L-histidin, 0,1 CaCO
3
, 0,5 NaCl, 2,5 agar, dan 0,003 phenol red, kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer
dan diencerkan menggunakan aquades hingga 1000 ml. Selanjutnya dipanaskan
hingga mendidih dan diatur pH 6 kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 ºC selama 15 menit.
Sampel sebanyak 25 gram dimasukkan ke dalam botol yang berisi 225 ml larutan b
utterfield’s phospate buffered steril, kemudian diblender hingga larutan homogen. Homogenat ini merupakan larutan pengenceran 10
-1
. Dari campuran tersebut kemudian diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam botol berisi 9 ml
larutan b utterfield’s phospate buffered sehingga diperoleh contoh dengan
pengenceran 10
-2
, kemudian dikocok hingga homogen. Pengenceran dilakukan hingga 10
-4
. Satu ml larutan sampel di setiap pengenceran dimasukkan ke dalam cawan petri, lalu 12-15 ml media Niven bersuhu 45 ºC dituangkan ke dalam
cawan berisi sampel. Setelah media Niven memadat, cawan petri dimasukkan dalam inkubator dengan posisi terbalik selama 48 jam pada suhu 35 ºC.
Pengamatan dilakukan dengan menghitung jumlah koloni dengan pink halo hingga purpe halo yang merupakan koloni bakteri pembentuk histamin.
3.5.5 Isolasi bakteri modifikasi Niven et al. 1981; Kung et al. 2009; Hwang et al
. 2010
Isolasi dan pemurnian bakteri bertujuan memperoleh isolat bakteri murni dari sampel, sehingga dapat dilakukan karakterisasi dan identifikasi bakteri yang
diperoleh. Isolasi bakteri yang dilakukan menggunakan metode gores kuadran, yaitu menggoreskan larutan sampel beberapa kali menggunakan lup inokulasi di
permukaan media kultur. Larutan sampel dari setiap pengenceran untuk analisis jumlah bakteri
pembentuk histamin atau ALT dipipet sebanyak 0,1 ml dan dituang ke media Niven lalu diinkubasi selama 4 hari pada suhu 35 ºC. Koloni berwarna biru atau
ungu digoreskan pada media trypticase soy agar TSA untuk memperoleh kultur murni. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah.
Isolat bakteri dikatakan murni jika diperoleh bentuk sel dan morfologi koloni
yang seragam. 3.5.6 Karakterisasi bakteri Tiwari et al. 2009
Karakterisasi bakteri meliputi pengujian terhadap morfologi koloni dan sel bakteri serta sifat fisiologis isolat murni yang diperoleh. Sebelum karakterisasi
bakteri dilakukan, penting dilakukan pengujian kemampuan bakteri menghasilkan
histamin. Pengujian tersebut bertujuan untuk meyakinkan bahwa isolat bakteri yang dimiliki merupakan BPH.
Kultur murni ditumbuhkan dalam 10 ml trypticase soy broth TSB yang ditambahkan 1 L-histidin atau disebut sebagai media trypticase soy broth
histidine TSBH, kemudian diinkubasi pada suhu 35 ºC selama 24 jam. Biakan
tersebut digunakan untuk pengujian kadar histamin yang dihasilkan bakteri sesuai BSN 2009
a
.
3.5.6.1 Morfologi koloni
Pengamatan morfologi koloni bertujuan mengetahui bentuk koloni dari atas, bentuk tepi, bentuk elevasi, dan warna koloni secara visual Lampiran 2.
3.5.6.2 Morfologi sel Tiwari et al. 2009
Pengamatan morfologi sel meliputi pewarnaan gram dan uji motilitas. Pewarnaan gram merupakan metode yang sangat bermanfaat untuk
mengidentifikasi bakteri berdasarkan perbedaan warna karena perbedaan komposisi kimia dan fisika dinding sel bakteri.
Pewarnaan gram diawali dengan mengolesi inokulum yang berumur 24 jam pada kaca objek dan difiksasi di atas api hingga kering. Kaca objek ditetesi
larutan kristal violet dan didiamkan selama 1 menit. Larutan kristal violet dibuang dengan memiringkan kaca objek dan dibilas dengan aquades lalu dikeringkan
dengan tisu. Selanjutnya kaca objek digenangi dengan larutan iodin selama 1 menit dan dibilas dengan alkohol 95 selama 15 detik, kemudian ditetesi dengan
safranin selama 45 detik dan dibilas dengan aquades serta dikeringkan dengan tisu. Saat pengamatan dengan mikroskop, kaca objek ditetesi minyak imersi.
Mikroskop di-setting memiliki perbesaran lensa objek 100 kali dan perbesaran lensa okuler 10 kali. Bila terbentuk warna merah muda, menandakan bakteri
Gram negatif, sedangkan bila terbentuk warna ungu, menandakan bakteri Gram positif.
Bentuk sel dari preparat bakteri juga dapat diamati melalui pewarnaan gram. Sel bakteri yang berbentuk seperti bola atau elips dinamakan kokus. Sel
bakteri yang berbentuk silindris atau batang dinamakan basilus. Bakteri berbentuk spiral atau spirilum terurtama dijumpai sebagai individu sel yang tidak saling
melekat Pelczar dan Chan 1986 Lampiran 3.
Uji motilitas dilakukan dengan cara menusukkan isolat bakteri ke dalam media semisolid agar dengan jarum ose tusuk steril, kemudian diinkubasi selama
semalam pada suhu 37 ºC. Bila pertumbuhan bakteri menyebar, maka bakteri tersebut motil dan bila pertumbuhan bakteri tidak menyebar atau hanya berupa
segaris mengikuti arah tusukan, maka bakteri non motil.
3.5.6.3 Uji sifat fisiologis Tiwari et al. 2009
Uji sifat fisiologis meliputi uji oksidase dan uji katalase. Sebanyak satu ose koloni bakteri digoreskan pada kertas Oxidase Test Strip untuk pengujian
oksidase. Perubahan warna yang terjadi pada tes strip diamati setelah 10-15 detik. Bila terjadi perubahan warna menjadi biru violet menandakan oksidase positif dan
bakteri termasuk bakteri non enterik, sedangkan bila tidak terjadi perubahan warna menandakan oksidase negatif dan bakteri termasuk bakteri enterik.
Uji katalase dilakukan dengan cara satu ose koloni bakteri dioleskan pada kaca objek kering dan diteteskan 2-3 tetes 3 H
2
O
2
. Bila terbentuk gelembung udara, maka bakteri dinyatakan katalase positif. Bakteri aerob memberikan reaksi
positif, sebaliknya pada bakteri anaerob.
3.5.7 Identifikasi bakteri bioMérieux 2006
Identifikasi bakteri dilakukan dengan menggunakan analytical profile index
API. API terdiri dari beberapa jenis dan bersifat spesifik terhadap karakteristik bakteri yang akan diidentifikasi. Skema pemilihan API untuk bakteri
Gram negatif, berbentuk batang dan tidak rewel non fastidious dapat dilihat pada Gambar 4.
Identifikasi bakteri yang bersifat Gram negatif, tidak rewel, dan oksidase positif dilakukan menggunakan API kit 20 NE dengan tahapan sebagai berikut
bioMérieux 2006
a
. 1.
Bakteri dengan koloni murni yang akan diuji disegarkan terlebih dahulu selama 18-24 jam.
2. Bakteri kemudian dilarutkan dalam garam fisiologis 0,85 sebanyak
6 ml dan dihomogenisasi, kemudian kekeruhan larutan diukur menggunakan nephelometer. Kekeruhan larutan sebesar 0,5 Mc Farland.
3. Sebanyak 0,2 ml larutan bakteri murni dihomogenkan dengan media API
AUX. 4.
Larutan media tersebut dipipet ke dalam cupules sumur API 20 NE menggunakan jarum suntik.
5. Cupules yangbertanda dipipet hingga penuh, yakni cupules GLU, ARA,
MNE, MAN, NAG, MAL,GNT, CAP, ADI, MLT, CIT, dan PAC. 6.
Cupules NO3, TRP, GLU, ADH, URE, ESC, GEL, dan PNPG dipipet hanya sampai setengah bagian cupules.
7. Cupules GLU, ADH, dan URE ditambahkan dengan minyak mineral.
8. Hasil dibaca setelah inkubasi selama 24±2 jam pada suhu 29±2 ºC.
9. Setelah inkubasi 24 jam, reagen James ditambahkan sebanyak 1 tetes pada
cupules TRP dan hasil dapat dibaca langsung. Reagen Nit 1 dan Nit 2
ditambahkan pada cupules NO
3
. 10.
Hasil perubahan warna dituliskan pada kertas hasil, kemudian kode angka yang diperoleh berdasarkan pembacaan hasil dimasukkan ke dalam
software API web. Spesies isolat akan ditampilkan sebagai hasil.
Identifikasi bakteri yang bersifat Gram negatif, tidak rewel, dan oksidase negatif dilakukan menggunakan API kit 20 E dengan tahapan sebagai berikut
bioMérieux 2006
b
. 1.
Bakteri dengan koloni murni yang akan diuji disegarkan terlebih dahulu selama 18-24 jam.
2. Bakteri kemudian dilarutkan dalam garam fisiologis 0,85 sebanyak
6 ml dan dihomogenisasi, kemudian kekeruhan larutan diukur menggunakan nephelometer. Kekeruhan larutan sebesar 0,5 Mc Farland.
3. Suspensi bakteri tersebut kemudian dipipet ke dalam cupules API 20 E
menggunakan pipet sekali pakai. 4.
Cupules yang bertanda dipipet hingga penuh, yakni cupules Cit, VP, dan Gel.
5. Cupules lainnya dipipet hanya sampai setengah bagian cupules.
6. Cupules ADH, LDC, ODC, H
2
S, dan URE ditambahkan dengan minyak mineral.
7. Hasil dibaca setelah inkubasi selama 18-24 jam pada suhu 36±2 ºC.
8. Setelah inkubasi 24 jam, reagen James ditambahkan sebanyak 1 tetes pada
cupules IND dan hasil dapat dibaca langsung. Reagen VP 1 dan VP 2
ditambahkan pada cupules VP, tunggu selama 10 menit untuk melihat perubahan warna. Reagen TDA ditambahkan pada cupules TDA.
9. Hasil perubahan warna dituliskan pada kertas hasil, kemudian kode angka
yang diperoleh berdasarkan pembacaan hasil dimasukkan ke dalam software
API web. Spesies isolat akan ditampilkan sebagai hasil.
Gambar 4 Skema pemilihan API bioMérieux 2006
ab
. Oksidase positif
Fermenter positif Bakteri Gram negatif bentuk batang
Oksidase positif Oksidase negatif
Oksidase positif Fermenter negatif
Oksidase positif Fermenter negatif
Oksidase negatif Fermenter positif
Non fermenter: API 20 NE
Fermenter: API 10 S
API 20 E Rapid 20 E
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Kadar Histamin Tuna Thunnus sp
Tuna merupakan ikan yang mengandung sejumlah asam amino histidin. Asam amino ini merupakan substrat bagi enzim histidine decarboxylase hdc,
baik yang dihasilkan oleh bakteri dalam daging maupun oleh ikan itu sendiri, untuk kemudian diubah menjadi histamin Frank et al. 1981; Hungerford 2010.
Hasil analisis histamin memperlihatkan bahwa kadar histamin daging tuna bagian ekor yang disimpan pada suhu 4-5 °C dan -2-1 °C serta daging tuna
bagian perut yang disimpan pada -2-1 °C selama 7 hari tidak melebihi 50 ppm, namun daging tuna bagian perut yang disimpan pada suhu 4-5 °C selama 7 hari
telah melebihi 50 ppm. FDA mengatur tentang kadar maksimum histamin untuk ikan yang dapat dikonsumsi, yakni tidak melebihi 50 ppm. Hal tersebut
disebabkan ketika terdeteksi histamin sebesar 50 ppm pada satu bagian tubuh, kemungkinan akan terdeteksi 500 ppm histamin pada bagian tubuh lainnya FDA
2001. Kadar histamin ikan tuna pada berbagai perlakuan yang diberikan dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5 Kadar histamin daging ikan tuna dalam satuan ppm pada berbagai kondisi perlakuan
Lama penyimpanan
Lokasi daging Perut
Ekor Suhu penyimpanan °C
4-5 -2-1
4-5 -2-1
0 hari 0,9732±0,1970
de
0,5479±0,4233
de
0,7961±1413
de
0,4483±0,1298
de
2 hari 7,3427±0,5483
c
1,2843±0,3847
de
1,2909±0,4461
de
1,1748±0,4719
de
7 hari 71,3474±0,8901
a
0,3445±0,1683
e
45,6645±0,6204
b
1,4266±0,9584
d
Keterangan: Huruf superscript yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata
Analisis ragam pada selang kepercayaan 95 menunjukkan bahwa interaksi antara ketiga perlakuan memberikan pengaruh yang nyata terhadap kadar
histamin pada daging ikan tuna. Lebih lanjut, hasil uji Duncan menunjukkan bahwa pada daging ikan tuna yang diambil di bagian ekor dengan suhu -2-1 °C
selama penyimpanan 0 dan 2 hari tidak menunjukkan adanya perbedaan yang nyata dengan perlakuan suhu 4-5 °C selama penyimpanan yang sama. Demikian
pula dengan daging ikan tuna yang diambil pada perut dengan suhu -2-1 °C
