BAB III METODOLOGI PENELITIAN
III.1. Desain Penelitian Penelitian yang dilakukan merupakan penelitian eksperimental dengan rancangan
acak sederhana. Sebanyak 36 ekor mencit betina Mus musculus L dibagi dalam 9 kelompok perlakuaan .Masing-masing kelompok terdiri atas 4 ekor mencit. Adapun
penentuan jumlah ulangan dengan menggunakan Rancangan Acak Sederhanamenurut Federer 1963 adalah sebagai berikut:
{t-1n-1} ≥ 15
Keterangan: n= besar sampel dalam kelompok perlakuan
t= banyaknya kelompok perlakukan 9 kelompok
III.2. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Medan. Penelitian dilakukan selama 6 minggu.
III.3. Populasi Penelitian
Mencit betina Mus musculus L, strain DDW, berumur 6-8 minggu dengan berat badan 20-35 gr. Hewan uji diperoleh dari Laboratorium Struktur dan Perkembangan
Hewan, Departemen Biologi, FMIPA, Universitas Sumatera Utara dan Laboratorium Hewan, Departemen Biologi, FMIPA, Universitas Negeri Medan.
III.4. Etika Penelitian
Penggunaan hewan penelitian telah dilakukan sesuai dengan aturan etika penelitian yang diatur dalam Deklarasi Helsinki dan telah memperoleh ”ethical
clearance” dari komite etik dan komite ilmiah penelitian bidang kesehatan Fakultas Kedokteran, USU.
III.5. Variabel Penelitian
III.5.1. Variabel independen : Asam askorbat 400 mgkgBB dan Pb dosis 20
mgkgBB, 40 mgkgBB, 80 mgkgBB, dan 160 mgkgBB.
III.5.2. Variabel dependen : Kadar MDA plasma dan jumlah eritrosit
III.5.3. Variabel kendali : Jenis kelamin, berat badan, umur, lingkungan
dan makanan.
III.6. Pelaksanaan Penelitian
III.6.1. Perawatan hewan percobaan Perawatan hewan percobaan dilakukan di Laboratorium Terpadu Fakultas
Kedokteran, Universitas Sumatera Utara, dalam kandang bersekat berkamar 36 buah dan diberi alas sekam padi. Masing-masaing kamar ditempatkan 1 ekor mencit.
Kandang ditempatkan dalam ruangan tertutup dengan temperatur ruangan 25± 2°C dan masuknya cahaya secara tidak langsung . Mencit diberi makanan sesuai standar
berupa pellet PC-05 produksi PT. Charoen Pokphan Medan dan diberi minum
aquades secara ad libitum. Sebelum perlakuan, hewan percobaan diaklimatisasi selama 1 minggu. Selama aklimatisasi, pengamatan dilakukan terhadap hewan
percobaan meliputi tingkah laku, kemampuan dalam mengkonsumsi makanan, serta penimbangan berat badan yang dilakukan di awal dan akhir masa aklimatisasi.
Kandang, tempat makan dan minum dibersihkan dan alas sekam padi diganti sedikitnya dua hari sekali Smith, 1988.
III.6.2. Perlakuan hewan percobaan Sampel yang terdiri dari 36 ekor mencit dibagi ke dalam sembilan kelompok yang
terdiri atas 4 ekor untuk setiap kelompok. Bahan uji larutan asam askorbat diberikan secara oral dengan menggunakan sonde gavage yaitu alat suntik dengan jarum yang
ujungnya telah ditumpulkan, sedangkan bahan uji larutan Pb asetat diberikan dengan cara diinjeksikan ke intraperitoneal. Volume pemberian bahan asam askorbat dan
Pb asetat adalah 0,1 mL10 gBB setiap hari sesuai prosedur pemberian sebagai berikut
1. Kelompok 1 n=4: Hewan dari kelompok ini hanya menerima air suling ganda Aquabidest.
2. Kelompok 2 n=4: Hewan dari kelompok ini diberi Pb asetat 20 mgkgBB secara intraperitoneal sekali pemberian.
3. Kelompok 3 n=4: Hewan dari kelompok ini diberi Pb asetat 40 mgkgBB secara intraperitoneal sekali pemberian.
4. Kelompok 4 n=4: Hewan dari kelompok ini diberi Pb asetat 80 mgkgBB secara intraperitoneal sekali pemberian.
5. Kelompok 5 n=4: Hewan dari kelompok ini diberi Pb asetat 160 mgkgBB secara intraperitoneal sekali pemberian.
6. Kelompok 6 n=4: Hewan dari kelompok ini diberi asam askorbat 400 mgkgBBhewan secara oral-gavage sekali sehari selama 7 hari berturut-
turut, sebelum pemberian Pb asetat. Pb asetat dengan dosis 20 mgkgBB diberikan secara intraperitoneal pada hari ke-7, satu jam setelah pemberian
asam askorbat. 7. Kelompok 7 n=4: Hewan dari kelompok ini diberi asam askorbat 400
mgkgBBhewan secara oral-gavage sekali sehari selama 7 hari berturut- turut, sebelum pemberian Pb asetat. Pb asetat dengan dosis 40 mgkgBB
diberikan secara intraperitoneal pada hari ke-7, satu jam setelah pemberian asam askorbat.
8. Kelompok 8 n=4: Hewan dari kelompok ini diberi asam askorbat 400 mgkgBBhewan secara oral-gavage sekali sehari selama 7 hari berturut-
turut, sebelum pemberian Pb asetat. Pb asetat dengan dosis 80 mgkgBB diberikan secara intraperitoneal pada hari ke-7, satu jam setelah pemberian
asam askorbat. 9. Kelompok 9 n=4: Hewan dari kelompok ini diberi asam askorbat 400
mgkgBBhewan secara oral-gavage sekali sehari selama 7 hari berturut- turut, sebelum pemberian Pb asetat. Pb asetat dengan dosis 160 mgkgBB
diberikan secara intraperitoneal pada hari ke-7, satu jam setelah pemberian asam askorbat.
Pemberian bahan percobaan secara oral dilakukan setiap hari antara pukul 08.30 - 10.30 WIB selama 7 hari berturut-turut.
Tabel 1. Perlakuan pada hewan coba
Kelompok DDWAquabidest
Asam Askorbat mgKgBB
Pb Asetat mgKgBB
1 √
- - 2 -
- 20 3 -
- 40 4 -
- 80 5 -
- 160 6 - 400
20 7 - 400
40 8 - 400
80 9 - 400
160
Pengambilan sampel darah mencit dilakukan 48 jam setelah perlakuan terakhir. Darah diambil secara intracardial menggunakan spuit 1 ml Terumo
TM
setelah dilakukan dislokasi leher. Sampel darah kemudian dimasukkan ke dalam cuvet yang
telah diberi heparin sebagai antikoagulan dan selanjutnya dilakukan pengukuran : 1 Kadar MDA plasma dan 2 Jumlah eritrosit. Dosis asam askorbat dan Pb serta
lamanya waktu pemberian dalam penelitian ini dimodifikasi dari penelitian yang dilakukan oleh Gajawat et al, 2006.
III.6.3 Pembuatan bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan A. Pembuatan larutan asam askorbat
Tepung Asam askorbat L-ascorbic acid; C
6
H
8
O
6
yang digunakan pada penelitian ini dilarutkan dalam air suling ganda dengan konsentrasi 40 mgmL dan diberikan
secara oral sekali sehari selama 7 hari berturut-turut pada mencit Mus musculus L, dengan dosis 400 mgkgBB
B. Pembuatan larutan Pb
Plumbum asetat dalam bentuk tepung C
4
H
6
O
4
Pb yang digunakan dalam penelitian ini disuntik secara intraperitoneal pada mencit dengan dosis sebagai
berikut: a Dosis 20 mgkgBB dibuat dalam konsentrasi 2 mgmL dengan air suling ganda sebagai pelarut,b Dosis 40 mgkgBB dibuat dalam konsentrasi 4 mgmL
dengan air suling ganda sebagai pelarut, c Dosis 80 mgkgBB dibuat dalam konsentrasi 8 mgmL dengan air suling ganda sebagai pelarut, d Dosis 160
mgkgBB dibuat dalam konsentrasi 16 mgmL dengan air suling ganda sebagai pelarut.
III.6.4. Prosedur pengukuran A. Pengukuran kadar MDA plasma
Menggunakan metode TBA Assay Hsieh et al, 2006. Alat : 1 Micropipette 200 L, 2 Micropipette 1000 L, 3 Micropipettes tips,
4 Tabung Microcentrifuge polypropylene, 5 Spectrophotometer Genesis 5
TM
, 6 Vortex mixer, 7Water bath, 8 Centrifuge, 9 Cuvette.
Bahan : 1 Reagensia MDA , 2 Aquadest, 3 Plasma darah.
Protokol kerja: Diisikan 100 L sampel plasma darah ke tabung microcentrifuge, lalu ditambahkan 900 L aquadest ke dalam tabung diatas. Selanjutnya ditambahkan
500 L reagensia TBA 2- Thiobarbituric acid. Kemudian tabung divortex lalu dipanaskan dalam waterbath pada suhu 95°C selama 60 menit. Tabung disentrifugasi
pada 7000 RPM selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam cuvet yang steril dan bersih lalu dibaca pada panjang gelombang 534 nm.
B. Penghitungan jumlah sel eritrosit Alat : 1 Pipette eritrosit, 2 Kamar hitung improved Neubauer, 3 Kaca
penutup cover glass
Bahan : 1 Reagensia Hayem, 2 Darah whole blood
Protokol kerja: Diisikan darah ke dalam pipet sampai 0.5, lalu kelebihan darah pada ujung pipet dihapus. Sambil menahan darah pada ujung pipet, diisikan larutan
Hayem sampai garis 101. Selanjutnya pipet diletakkan pada posisi horizontal agar cairan tidak keluar. Tekan kedua ujung pipet, kemudian goyang selama 3-5 menit
lalu cairan dibuang sebanyak 3 tetes, selanjutnya dengan posisi 30 derajat cairan diteteskan ke dalam kamar hitung yang telah ditutup dengan kaca penutup. Kamar
hitung dibiarkan selama 2 menit. Kemudian eritrosit dihitung dibawah mikroskop dengan pembesaran 40x.
Cara penghitungan: Bidang yang dihitung adalah 5 bidang kecil: E1+E2+E3+E4+E5. Pengenceran eritrosit 200x , tinggi kamar hitung 110 mm, seluruh permukaan kamar
hitung adalah 15 mm, maka faktor perkalian adalah : 510200 = 10000mm
3
. Sehingga jumlah eritrosit = E1+E2+E3+E4+E5 10000mm
3
.
III.7. Analisa Data
Seluruh data yang diperoleh dianalisa dengan program SPSS versi 11.5. Perbedaan rerata kadar MDA dan jumlah eritrosit dianalisa menggunakan uji
ANOVA untuk data berdistribusi normal. Bila terdapat perbedaan dilanjutkan dengan uji multiple comparition test MCT yaitu uji Bonferoni pada tingkat kemaknaan
p0.05. Bila data tidak berdistribusi normal, dilakukan uji Kruskal Wallis. Korelasi antara kadar MDA dan jumlah eritrosit dianalisa menggunakan uji korelasi Pearson.
III.8. Kerangka kerja
Selama 7 hari
Setelah 48 jam Mencit , 6-8 minggu,
BB 20-35 gr
1 Aquabidest
Asam askorbat 400 mgkgBB sekalihari
1 jam setelah pemberian asam askorbat hari ke-7
6 Pb 20
mgkgBB 7
Pb 40 mgkgBB
8 Pb 80
mgkgBB 9
Pb 160 mgkgBB
2 Pb 20
mgkgBB 3
Pb 40 mgkgBB
4 Pb 80
mgkgBB 5
Pb 160 mgkgBB
Aklimatisasi 1 minggu
Diperiksa kadar MDA plasma, jumlah eritrosit
Gambar 6. Kerangka kerja penelitian
BAB 1V HASIL DAN PEMBAHASAN
Kategori