Rancangan Penelitian Kerangka Opersional Definisi Operasional Larutan I Instrumen Penelitian

Bab 3 Metodologi Penelitian

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian 3.1.1 Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan di laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara dan laboratorium swasta di Medan.

3.1.2. Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan selama bulan April tahun 2008 sampai dengan bulan Agustus tahun 2008, yang meliputi studi kepustakaan, pengumpulan data, pengumpulan sampel, penelitian dan penulisan.

3.2. Rancangan Penelitian

Penelitian ini menggunakan rancangan studi potong lintang yang bersifat deskriptif analitik untuk menilai perbandingan sitomorfometri antara fibroadenoma , karsinoma duktus dan lobular pada payudara.

3.3. Kerangka Opersional

Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009 Biopsi Aspirasi Payudara Pemilihan Sampel Pewarnaan 1 slide dengan feulgen , 1 slide dengan Diff Quik Kriteria Inklusi Kriteria Eksklusi Pengukuran data dengan perangkat lunak MCID Pengukuran perimeter dan kandungan DNA

3.4. Populasi , Sampel dan Besar Sampel Penelitian

3.4.1. Populasi

Populasi penelitian adalah pasien biopsi aspirasi jarum halus lesi pada payudara yang teraba yang didiagnosa sebagai fibroadenoma dan karsinoma payudara. Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009

3.4.2. Sampel

Sampel dalam penelitian ini adalah sediaan sitologi dari biopsi aspirasi lesi pada payudara yang teraba yang memenuhi kriteria inklusi dan diperoleh sejak bulan April tahun 2008 sampai bulan Agustus tahun 2008

3.4.3. Besar Sampel

Besar Sampel yang diperlukan adalah berdasarkan hasil perhitungan uji beda dua mean independen, yang bertujuan untuk mengetahui perbedaan mean dari 2 kelompok independen , dengan rumus: N = 2 j 2 Z g + Z 3 2 k1 – k2 2 Keterangan : N = besar sampel j = standard deviasi = 3,2 k1 – k2 = 5 g = tingkat kemaknaan, tingkat kemaknaan yang diperlukan pada penelitian ini adalah 0,05 dengan dengan interval kepercayaan 95 . Dari tabel didapat Z g = 1,96 Z3 = 90 , dari tabel didapat Z3 = 1,28 Dari perhitungan perhitungan tersebut diatas didapati jumlah sampel sebanyak 6,2 Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009 ~ 7 sampel pada masing-masing kelompok

3.5. Kriteria Inklusi dan Eksklusi

3.5.1. Kriteria Inklusi

1. Sampel diambil dari pasien yang berumur 14 tahun keatas sudah mendapat haid 2. Sampel diambil dari biopsi aspirasi lesi payudara yang teraba yang kemudian difiksasi dengan alkohol 96 3. Sampel slide yang diambil adalah sampel slide yang sebelumnya telah didiagnosa sebagai fibroadenoma, karsinoma duktus dan karsinoma lobular payudara dengan pewarnaan Diff – Quik serta yang sudah dikorfirmasi dengan sediaan histopatologinya. 4. Dari sampel slide yang ada dipilih sediaan sitologi yang baik dengan kriteria: - Sel-sel tersebar merata - Tidak terdapat tumpang tindih dari sel overlapping - Sitoplasma dan inti sel dapat diidentifikasi dengan baik - Kromatin dan nukleoli dapat dikenali

3.5.2. Kriteria Eksklusi

a. Sellularitas sel yang rendah b. Sediaan tidak adekuat dan tidak dapat didagnosa c. Sediaan yang didiagnosa sebagai metastase karsinoma d. Sediaan dengan artefak yang banyak e. Sediaan dengan pewarnaan yang kurang baik. Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009

3.6. Definisi Operasional

Variabel • Fibroadenoma payudara adalah lesi jinak payudara berupa adanya nodul akibat dari proliferasi kelenjar dan jaringan ikat fibrous pada payudara • Karsinoma duktus adalah lesi ganas pada payudara dengan dijumpainya sel-sel malignan pada duktus payudara. • Karsinoma lobular payudara adalah lesi ganas dengan dijumpainya sel-sel malignan pada lobulus payudara. • Densitas adalah proporsi gelapnya dari banyaknya transmisi atau refleksi warna dari inti yang menggambarkan kandungan DNA dari inti yang dinilai secara kuantitatif. Makin banyak zat warna yang diserap maka terjadi perubahan warna menjadi lebih merah. • Keliling inti adalah panjang dari keliling membran inti • Biopsi aspirasi jarum halus adalah pengambilan sediaan sitologi terhadap lesi dari payudara yang teraba dengan menggunakan pistolet dan spuit 10 cc. • Analisa gambar adalah pengukuran kualitatif dan kuantitatif sediaan sitologi secara komputerisasi.

3.7. Prosedur dan

Tehnik Pelaksanaan 3.7.1. Pengambilan Sampel Sitologi 3.7.1.1. Lokasi pengambilan sampel sitologi Lokasi pengambilan sampel adalah lesi pada payudara yang teraba. Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009

3.7.1.2. Peralatan Untuk Biopsi Aspirasi Jarum Halus

- Jarum Halus Jarum disposible terbuat dari plastik, berukuran 23-22 gauge 0,6-0,7 mm merupakan jarum halus dengan panjang 30-50 mm. - Tabung Suntik Tabung suntik terbuat dari plastik disposible syringe berukuran 10 ml, rigid dan mampu menghasilkan tekanan negatif ataupun ruangan vakum didalam tabung suntik. - Pemegang Tabung Suntik Alat pemegang tabung suntik pistolet Cameco Swedia , terbuat dari metal dengan disain sedemikian rupa sehingga tabung suntik melekat erat pada pemegang tersebut. - Peralatan Lainnya Alat tambahan terdiri dari kaca obyek, bahan fiksatif alkohol 70 – 90 , desinfektan alkohol, kapas dan plester penutup tempat insersi jarum.

3.7.2. Prosedur dan Pengambilan Sediaan Sitologi

1. Nodul atau lesi difiksasi diantara jari tangan, sambil kulit diatasnya diregangkan. Pada posisi piston jarum suntik dibagian distal, jarum diinsersikan ke dalam massa tumor. 2. Apabila jarum sudah berada didalam massa tumor, piston ditarik ke arah proksimal dan tekanan didalam tabung menjadi negatif. 3. Pada posisi tersebut diatas , jarum digerakkan maju mundur , sehingga aspirat yang mengandung sejumlah sel tumor masuk ke dalam lumen jarum atau tabung suntik. Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009 Menurut Thompson, dengan gerakan maju mundur dari ujung jarum, terjadi selective sampling yang merupakan mekanisme biopsi aspirasi untuk memperoleh sediaan aspirat yang representatif. Tetapi apabila sediaan kurang representatif , biosi aspirasi dapat diulang pada bagian lainnya multiple hole. Pada waktu melakukan aspirasi, muara jarum needle hub harus diamati. Apabila aspirat sudah kelihatan pada muara jarum , pegangan piston dilepaskan untuk mencegah aspirat masuk ke dalam tabung suntik sehingga sulit untuk dikeluarkan. 4. Sebelum jarum suntik dikeluarkan, piston didalam tabung suntik dikembalikan ketempat semula dengan melepaskan pegangan piston, sehingga tekanan didalam tabung kembali seperti semula. Tujuannya untuk mencegah masuknya aspirat yang berada diluar massa tumor pada waktu jarum dicabut, yang dapat mengacaukan pemeriksaan sitologi aspirat tumor. 5. Untuk mengeluarkan aspirat, jarum dibebaskan dari tabung suntik, piston ditarik kearah proksimal kemudian jarum disatukan kembali dengan tabung. Tekanan didalam tabung menjadi positif . Lalu ujung jarum diletakkan diatas kaca objek, piston didorong dan aspirat diletakkan diatas kaca objek, dibuat sediaan apus dan difiksasi dengan alkohol. 6. Dalam membuat sediaan apus, tekanan pada tangan tidak boleh terlalu pelan, karena akan menghasilkan sediaan apus yang terlalu tebal sehingga sulit untuk diwarnai. Tekanan juga tidak boleh terlalu kuat karena akan menyebabkan sebagian besar dari populasi sel mengalami distorsi dan sulit diinterprestasi. Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009

3.7.3 Pewarnaan

3.7.3.1. Pewarnaan Dengan Diff-Quik Stain Set

Untuk menentukan diagnosa awal pada fibroadenoma dan karsinoma payudara dilakukan pewarnaan MGG Diff Quik. Larutan Yang Diperlukan a. Larutan Fiksatif Triarylmethane Dye, 100 PDC Methyl Alcohol, dalam konsentrasi 0,002 gliter

b. Larutan I

Xanthene Dye, 100 PDC Buffer Sodium Azide, dalam konsentrasi 1,25 gliter

c. Larutan II

Thiazine Dye Mixture, 100 PDC Buffer dalam konsentrasi 1,25 gliter. Prosedur Pewarnaan Diff - Quik 1. Celupkan sediaan kedalam larutan fiksatif selama 5 detik 5 kali celup masing-masing satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir 2. Celupkan sediaan kedalam larutan I selama 5 detik 5 kali celup masing – masing satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir. 3. Celupkan sediaan kedalam larutan II selama 5 detik 5 kali celup masing-masing satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir. 4. Cuci sediaan dengan air destilasi atau air diionisasi Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009 5. Keringkan dan dibaca

3.7.3.2 Prosedur Pewarnaan Feulgen

Merupakan pewarnaan khusus untuk melihat kandungan DNA, sediaan diambil dari pasien yang sama dan dilakukan pewarnaan Feulgen. Reagent : • 1N Hydrochloric acid Hydrochloric acid 8,5 ml Distilled water 91,5 ml • Schiff’s Commercially prepared by Fisher Co. • 10 Sodium Metabisulfit Sodium Metabisulfit 10 gm Distilled water 100 ml • Sulfurous Rinse 10 Sodium Metabisulfit 12 ml 1N Hydrochloric Acid 10 ml Distilled water 200 ml • Fast Green Fast Green FCF 0,05 gm 95 alcohol 100,00 ml Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009 Prosedur: 1. Letakkan sediaan dalam 1N Hydrochloric acid pada toples coplin plastic dengan penutup yang tidak terlalu ketat, panaskan dengan microwave sampai 70 selama 45 menit 2. Aliri slide , jangan dibilas 3. Masukkan ke dalam reagensia Schiff selama 15 menit 4. Bilas 3 kali dengan Metabisulfit masing-masing selama 2 menit 5. Bilas dengan tap water selama 5 menit 6. Masukkan kedalam Fast Green selama 10 detik 7. Dehidasi, clearing, mounting Hasil : Kromatin ini berwarna magenta Latar belakang berwarna hijau. 31,32,33,34

3.7.4 Pengambilan Gambar

Gambar diambil langsung dari mikroskop dengan meletakkan kamera pada lensa mikroskop sehingga bisa mengambil foto langsung dari mikroskop. Lensa okuler mikroskop yang digunakan adalah pembesaran 10x dan lensa objektif yang digunakan adalah pembesaran 40x untuk pengukuran perimeter inti sel dan pembesaran 100x untuk pengukuran densitas inti . Pada waktu pengambilan gambar , pada kamera dilakukan zoom sebanyak 2x. Kemudian hasil foto dipindahkan kekomputer dalam bentuk Tiff.

3.7.5 Pengukuran Sampel

Pengukuran sampel dilakukan dengan menggunakan pen mouse yang kemudian dinilai oleh soft ware khusus untuk mengukur panjang keliling dari Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009 inti sel dan densitas inti dengan mengukur intensitas warna dari inti sel yang telah diwarnai dengan Diff-Quik dan Feulgen kandungan DNA.

3.7.6 Pemilihan dan Diagnosa Sampel

Pemilihan sampel dilakukan oleh peneliti dengan memilih 50 sel dan diagnosa sampel sitologi dilakukan oleh seorang ahli patologi anatomi konsultan sitopatologi.

3.7.7 Pengukuran Parameter

Pengukuran parameter pada tiap sediaan adalah panjang rata-rata keliling inti perimeter, deviasi standard dari perimeter inti dan densitas inti melalui intensitas warna kandungan DNA dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak khusus MCID TM core. 3.8 Alat-Alat dan Bahan Penelitian 3.8.1 Alat-Alat Penelitian - Pistolet Cameco Swedia - Spuit 10 cc no. 23 dengan diameter 0.65 mm dan panjang 3 atau 9 cm. - Mikroskop Olympus CX21 - Pen mouse merek Genius G-pen 450 - Kamera digital Samsung L830 8,1 mega pixels

3.8.2 Bahan Penelitian Antara Lain

- Kapas alkohol - Diff Quik Stain Set Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009 - Feulgen Stain Set - Kaca objek

3.9. Instrumen Penelitian

Instrumen penelitian yang digunakan adalah pengaturan dan pengambilan gambar yang sesuai dengan ketentuan : Dimensi pixel : lebar 640 pixel, panjang 480 pixel Ukuran Gambar : lebar 16,93 cm , panjang 12,7 cm Resolusi 96 pixel inci Penelitian ini dilakukan dalam temperatur berkisar 25-28 C Pada penelitian ini menggunakan soft ware MCID TM core untuk menganalisa gambar. Sebelumnya gambar dari kamera disimpan ke komputer dalam bentuk TIFF, kemudian dimasukkan kedalam soft ware ini. Gambar akan ditampilkan dengan meng-klik image file retrieval . Selanjutnya klik-sample pada menu, klik-selecting measure dan pilih densitas, basic morfometri - perimeter . Setelah itu dilakukan segmentasi pada inti dengan menggunakan pen mouse MCID TM core dan pada layar komputer akan akan muncul tabel ukuran perimeter dan densitas dari tiap inti yang diukur. Dari total ukuran perimeter dan densitas inti tersebut diambil nilai rata-rata dan selanjutnya dipindahkan dalam bentuk histogram. 29 Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009

3.10. Teknik Analis Data