Bab 3 Metodologi Penelitian
3.1. Tempat dan Waktu Penelitian 3.1.1 Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara dan laboratorium swasta di Medan.
3.1.2. Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan selama bulan April tahun 2008 sampai dengan bulan Agustus tahun 2008, yang meliputi studi kepustakaan, pengumpulan data,
pengumpulan sampel, penelitian dan penulisan.
3.2. Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan rancangan studi potong lintang yang bersifat deskriptif analitik untuk menilai perbandingan sitomorfometri antara
fibroadenoma , karsinoma duktus dan lobular pada payudara.
3.3. Kerangka Opersional
Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009
Biopsi Aspirasi Payudara
Pemilihan Sampel
Pewarnaan 1 slide dengan
feulgen , 1 slide dengan Diff Quik
Kriteria Inklusi
Kriteria Eksklusi
Pengukuran data dengan perangkat lunak MCID
Pengukuran perimeter dan kandungan DNA
3.4. Populasi , Sampel dan Besar Sampel Penelitian
3.4.1. Populasi
Populasi penelitian adalah pasien biopsi aspirasi jarum halus lesi pada payudara yang teraba yang didiagnosa sebagai fibroadenoma dan karsinoma
payudara.
Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009
3.4.2. Sampel
Sampel dalam penelitian ini adalah sediaan sitologi dari biopsi aspirasi lesi pada payudara yang teraba yang memenuhi kriteria inklusi dan diperoleh
sejak bulan April tahun 2008 sampai bulan Agustus tahun 2008
3.4.3. Besar Sampel
Besar Sampel yang diperlukan adalah berdasarkan hasil perhitungan uji beda dua mean independen, yang bertujuan untuk mengetahui perbedaan mean
dari 2 kelompok independen , dengan rumus:
N = 2 j
2
Z g + Z 3
2
k1 – k2
2
Keterangan :
N = besar sampel j = standard deviasi = 3,2
k1 – k2 = 5 g = tingkat kemaknaan, tingkat kemaknaan yang diperlukan pada penelitian
ini adalah 0,05 dengan dengan interval kepercayaan 95 . Dari tabel didapat Z
g = 1,96 Z3 = 90 , dari tabel didapat Z3 = 1,28
Dari perhitungan perhitungan tersebut diatas didapati jumlah sampel sebanyak 6,2
Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009
~ 7 sampel pada masing-masing kelompok
3.5. Kriteria Inklusi dan Eksklusi
3.5.1. Kriteria Inklusi
1. Sampel diambil dari pasien yang berumur 14 tahun keatas sudah mendapat haid
2. Sampel diambil dari biopsi aspirasi lesi payudara yang teraba yang kemudian difiksasi dengan alkohol 96
3. Sampel slide yang diambil adalah sampel slide yang sebelumnya telah didiagnosa sebagai fibroadenoma, karsinoma duktus dan karsinoma
lobular payudara dengan pewarnaan Diff – Quik serta yang sudah dikorfirmasi dengan sediaan histopatologinya.
4. Dari sampel slide yang ada dipilih sediaan sitologi yang baik dengan kriteria:
- Sel-sel tersebar merata -
Tidak terdapat tumpang tindih dari sel overlapping - Sitoplasma dan inti sel dapat diidentifikasi dengan baik
- Kromatin dan nukleoli dapat dikenali
3.5.2. Kriteria Eksklusi
a. Sellularitas sel yang rendah
b. Sediaan tidak adekuat dan tidak dapat didagnosa
c. Sediaan yang didiagnosa sebagai metastase karsinoma
d. Sediaan dengan artefak yang banyak
e. Sediaan dengan pewarnaan yang kurang baik.
Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009
3.6. Definisi Operasional
Variabel
• Fibroadenoma payudara adalah lesi jinak payudara berupa adanya nodul akibat dari proliferasi kelenjar dan jaringan ikat fibrous pada
payudara • Karsinoma duktus adalah lesi ganas pada payudara dengan
dijumpainya sel-sel malignan pada duktus payudara. • Karsinoma lobular payudara adalah lesi ganas dengan dijumpainya
sel-sel malignan pada lobulus payudara. • Densitas adalah proporsi gelapnya dari banyaknya transmisi atau
refleksi warna dari inti yang menggambarkan kandungan DNA dari inti yang dinilai secara kuantitatif. Makin banyak zat warna yang diserap
maka terjadi perubahan warna menjadi lebih merah. • Keliling inti adalah panjang dari keliling membran inti
• Biopsi aspirasi jarum halus adalah pengambilan sediaan sitologi terhadap lesi dari payudara yang teraba dengan menggunakan pistolet
dan spuit 10 cc. • Analisa gambar adalah pengukuran kualitatif dan kuantitatif sediaan
sitologi secara komputerisasi.
3.7. Prosedur dan
Tehnik Pelaksanaan
3.7.1. Pengambilan Sampel Sitologi 3.7.1.1. Lokasi pengambilan sampel sitologi
Lokasi pengambilan sampel adalah lesi pada payudara yang teraba.
Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009
3.7.1.2. Peralatan Untuk Biopsi Aspirasi Jarum Halus
- Jarum Halus
Jarum disposible terbuat dari plastik, berukuran 23-22 gauge 0,6-0,7 mm merupakan jarum halus dengan panjang 30-50 mm.
- Tabung Suntik
Tabung suntik terbuat dari plastik disposible syringe berukuran 10 ml, rigid dan mampu menghasilkan tekanan negatif ataupun ruangan vakum
didalam tabung suntik. -
Pemegang Tabung Suntik
Alat pemegang tabung suntik pistolet Cameco Swedia , terbuat dari metal dengan disain sedemikian rupa sehingga tabung suntik melekat erat
pada pemegang tersebut. -
Peralatan Lainnya
Alat tambahan terdiri dari kaca obyek, bahan fiksatif alkohol 70 – 90 , desinfektan alkohol, kapas dan plester penutup tempat insersi jarum.
3.7.2. Prosedur dan Pengambilan Sediaan Sitologi
1. Nodul atau lesi difiksasi diantara jari tangan, sambil kulit diatasnya diregangkan. Pada posisi piston jarum suntik dibagian distal, jarum
diinsersikan ke dalam massa tumor. 2. Apabila jarum sudah berada didalam massa tumor, piston ditarik ke
arah proksimal dan tekanan didalam tabung menjadi negatif. 3. Pada posisi tersebut diatas , jarum digerakkan maju mundur , sehingga
aspirat yang mengandung sejumlah sel tumor masuk ke dalam lumen jarum atau tabung suntik.
Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009
Menurut Thompson,
dengan gerakan maju mundur dari ujung jarum, terjadi
selective sampling yang merupakan mekanisme biopsi aspirasi
untuk memperoleh sediaan aspirat yang representatif. Tetapi apabila sediaan kurang representatif , biosi aspirasi dapat diulang pada bagian
lainnya multiple hole. Pada waktu melakukan aspirasi, muara jarum needle hub harus diamati. Apabila aspirat sudah kelihatan pada muara
jarum , pegangan piston dilepaskan untuk mencegah aspirat masuk ke dalam tabung suntik sehingga sulit untuk dikeluarkan.
4. Sebelum jarum suntik dikeluarkan, piston didalam tabung suntik dikembalikan ketempat semula dengan melepaskan pegangan piston,
sehingga tekanan didalam tabung kembali seperti semula. Tujuannya untuk mencegah masuknya aspirat yang berada diluar massa tumor
pada waktu jarum dicabut, yang dapat mengacaukan pemeriksaan sitologi aspirat tumor.
5. Untuk mengeluarkan aspirat, jarum dibebaskan dari tabung suntik, piston
ditarik kearah proksimal kemudian jarum disatukan kembali dengan tabung. Tekanan didalam tabung menjadi positif . Lalu ujung jarum
diletakkan diatas kaca objek, piston didorong dan aspirat diletakkan diatas kaca objek, dibuat sediaan apus dan difiksasi dengan alkohol.
6. Dalam membuat sediaan apus, tekanan pada tangan tidak boleh terlalu
pelan, karena akan menghasilkan sediaan apus yang terlalu tebal sehingga sulit untuk diwarnai. Tekanan juga tidak boleh terlalu kuat
karena akan menyebabkan sebagian besar dari populasi sel mengalami distorsi dan sulit diinterprestasi.
Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009
3.7.3 Pewarnaan
3.7.3.1. Pewarnaan Dengan Diff-Quik Stain Set
Untuk menentukan diagnosa awal pada fibroadenoma dan karsinoma payudara dilakukan pewarnaan MGG Diff Quik.
Larutan Yang Diperlukan a. Larutan Fiksatif
Triarylmethane Dye, 100 PDC Methyl Alcohol, dalam konsentrasi 0,002 gliter
b. Larutan I
Xanthene Dye, 100 PDC Buffer
Sodium Azide, dalam konsentrasi 1,25 gliter
c. Larutan II
Thiazine Dye Mixture, 100 PDC Buffer dalam konsentrasi 1,25 gliter.
Prosedur Pewarnaan Diff - Quik
1. Celupkan sediaan kedalam larutan fiksatif selama 5 detik 5 kali celup masing-masing satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir
2. Celupkan sediaan kedalam larutan I selama 5 detik 5 kali celup masing – masing satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir.
3. Celupkan sediaan kedalam larutan II selama 5 detik 5 kali celup masing-masing satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir.
4. Cuci sediaan dengan air destilasi atau air diionisasi
Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009
5. Keringkan dan dibaca
3.7.3.2 Prosedur Pewarnaan Feulgen
Merupakan pewarnaan khusus untuk melihat kandungan DNA, sediaan diambil dari pasien yang sama dan dilakukan pewarnaan Feulgen.
Reagent : • 1N Hydrochloric acid
Hydrochloric acid 8,5 ml
Distilled water
91,5 ml • Schiff’s
Commercially prepared by Fisher Co. • 10 Sodium Metabisulfit
Sodium Metabisulfit 10 gm
Distilled water
100 ml
• Sulfurous Rinse
10 Sodium Metabisulfit 12 ml
1N Hydrochloric Acid 10 ml
Distilled water 200 ml
• Fast Green
Fast Green FCF 0,05 gm
95 alcohol 100,00 ml
Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009
Prosedur: 1. Letakkan sediaan dalam 1N Hydrochloric acid pada toples coplin plastic
dengan penutup yang tidak terlalu ketat, panaskan dengan microwave sampai 70 selama 45 menit
2. Aliri slide , jangan dibilas 3. Masukkan ke dalam reagensia Schiff selama 15 menit
4. Bilas 3 kali dengan Metabisulfit masing-masing selama 2 menit 5. Bilas dengan tap water selama 5 menit
6. Masukkan kedalam Fast Green selama 10 detik 7. Dehidasi, clearing, mounting
Hasil : Kromatin ini berwarna magenta
Latar belakang berwarna hijau.
31,32,33,34
3.7.4 Pengambilan Gambar
Gambar diambil langsung dari mikroskop dengan meletakkan kamera pada lensa mikroskop sehingga bisa mengambil foto langsung dari mikroskop.
Lensa okuler mikroskop yang digunakan adalah pembesaran 10x dan lensa objektif yang digunakan adalah pembesaran 40x untuk pengukuran perimeter
inti sel dan pembesaran 100x untuk pengukuran densitas inti . Pada waktu pengambilan gambar , pada kamera dilakukan zoom sebanyak 2x. Kemudian
hasil foto dipindahkan kekomputer dalam bentuk Tiff.
3.7.5 Pengukuran Sampel
Pengukuran sampel dilakukan dengan menggunakan pen mouse yang kemudian dinilai oleh soft ware khusus untuk mengukur panjang keliling dari
Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009
inti sel dan densitas inti dengan mengukur intensitas warna dari inti sel yang telah diwarnai dengan Diff-Quik dan Feulgen kandungan DNA.
3.7.6 Pemilihan dan Diagnosa Sampel
Pemilihan sampel dilakukan oleh peneliti dengan memilih 50 sel dan diagnosa sampel sitologi dilakukan oleh seorang ahli patologi anatomi konsultan
sitopatologi.
3.7.7 Pengukuran Parameter
Pengukuran parameter pada tiap sediaan adalah panjang rata-rata keliling inti perimeter, deviasi standard dari perimeter inti dan densitas inti melalui
intensitas warna kandungan DNA dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak khusus MCID
TM
core.
3.8 Alat-Alat dan Bahan Penelitian 3.8.1 Alat-Alat Penelitian
- Pistolet Cameco Swedia - Spuit 10 cc no. 23 dengan diameter 0.65 mm dan panjang 3 atau 9 cm.
- Mikroskop Olympus CX21 - Pen mouse merek Genius G-pen 450
- Kamera digital Samsung L830 8,1 mega pixels
3.8.2 Bahan Penelitian Antara Lain
- Kapas alkohol
- Diff Quik Stain Set
Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009
- Feulgen Stain Set - Kaca
objek
3.9. Instrumen Penelitian
Instrumen penelitian yang digunakan adalah pengaturan dan pengambilan gambar yang sesuai dengan ketentuan :
Dimensi pixel : lebar 640 pixel, panjang 480 pixel Ukuran Gambar : lebar 16,93 cm , panjang 12,7 cm
Resolusi 96 pixel inci Penelitian ini dilakukan dalam temperatur berkisar 25-28
C Pada penelitian ini menggunakan soft ware MCID
TM
core untuk menganalisa gambar. Sebelumnya gambar dari kamera disimpan ke komputer dalam
bentuk TIFF, kemudian dimasukkan kedalam soft ware ini. Gambar akan ditampilkan dengan meng-klik
image file retrieval . Selanjutnya klik-sample
pada menu, klik-selecting measure dan pilih densitas, basic
morfometri - perimeter . Setelah itu dilakukan segmentasi pada inti dengan menggunakan
pen mouse MCID
TM
core dan pada layar komputer akan akan muncul tabel ukuran perimeter dan densitas dari tiap inti yang diukur. Dari total ukuran
perimeter dan densitas inti tersebut diambil nilai rata-rata dan selanjutnya dipindahkan dalam bentuk histogram.
29
Fitriani Lumongga : Perbedaan Nilai Numerik Kuantitasi Sitomorfometri Terhadap Keliling Dan Densitas Inti Pada Fibroadenoma, Karsinoma Duktus Dan Karsinoma Lobular Payudara, 2009
3.10. Teknik Analis Data