Waktu dan Tempat Alat dan Bahan Karakteristik Bakteri Tanah Pertanian Berastagi Sumatera Utara

BAB 3 BAHAN DAN METODA

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret sampai dengan November 2012 di Laboratorium Mikrobiologi dan Kultur Jaringan Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan dan Balai Pengujian Mutu Produk Tanaman, Jakarta.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain sentrifuse, shaker, spektrofotometer dan Kromatografi Gas Varian CP-3800 kolom ZB-1 30m x 0,25mm x 0,25µm dengan detector ECD. Bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain sampel tanah pertanian Berastagi, insektisida berbahan aktif karbosulfan dengan merek dagang Marshal 200 EC, media Bushnell Haas Broth BHB, Bushnell Haas Agar BHA terdiri atas KH 2 PO 4 , K 2 HPO 4, NH 4 NO 3, MgSO 4 .7H 2 O, FeCl 3 , CaCl 2 .2H 2 O, agar, H 2 SO 4 , larutan orsinol, NaHCO 3 0,05 M, rhamnosa, dietileter, Tripton Soy Agar TSA, Plate Count Agar PCA, larutan standard Mc-Farland, akuades, sodium bikarbonat, N-heksan, diklorometan, isooktan, toluene dan alkohol 70. 3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Isolasi Bakteri Sampel tanah diambil dari tanah pertanian Berastagi yang mengandung pestisida. Pengambilan sampel tanah dilakukan pada empat lokasi pertanian cabai, jeruk, kol, dan tomat. Sampel tanah diambil sebanyak 1 kg dan dimasukkan dalam plastik steril secara aseptis. Sampel tanah dibawa ke laboratorium, ditimbang sebanyak 1 gram dan diencerkan dalam 10 ml akuades steril hingga 10 -2 , diinokulasikan sebanyak 0,1 ml ke media BHA yang telah mengandung 12 ppm karbosulfan dengan merek dagang Marshal 200 EC. Sampel yang telah diinokulasikan ke media diinkubasi pada suhu 30 o C selama 10-15 hari. Koloni isolat yang tumbuh dimurnikan pada media TSA. Alur kerja isolasi bakteri dapat dilihat pada Lampiran 2. halaman 33.

3.3.2 Karakterisasi Morfologi dan Sifat Biokimia Bakteri

Koloni bakteri yang tumbuh pada media BHA dikarakterisasi berdasarkan sifat biokimia dan bentuk morfologinya. Karakterisasi morfologi yang diamati adalah bentuk, tepi, elevasi dan warna koloni secara makroskopis. Karakterisasi secara mikroskopis meliputi bentuk, penataan selnya serta sifat Gramnya yang diamati dengan mikroskop cahaya. Pewarnaan Gram menggunakan pewarna safranin dan kristal violet. Sifat biokimia yang diamati mencakup uji katalase dengan menggunakan larutan H 2 O 2 3, uji motilitas dengan media Sulfide Indole Motility SIM, uji sitrat dengan media Simmon’s Citrat Agar SCA, uji gelatin dengan media gelatin semi solid, uji hidrogen sulfida dan fermentasi gula dengan media Triple Sugar Iron Agar TSIA, uji hidrolisis pati dengan media Starch Agar SA. Untuk uji motilitas, uji sitrat, uji gelatin, uji hidrogen sulfida dan fermentasi gula serta uji hidrolisis pati diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30 o C, lalu diamati perubahan yang terjadi Cappuccino Sherman, 1983; Lay, 1994. Alur kerja karakteristik morfologi dan sifat biokimia bakteri dapat dilihat pada Lampiran 3. halaman 34.

3.3.3 Pengukuran Pertumbuhan Isolat

Pertumbuhan isolat selama masa inkubasi dilakukan dengan menumbuhkan bakteri pada media mineral BHB yang mengandung 12 ppm karbosulfan. Sebanyak 2 ml inokulum cair isolat bakteri yang setara dengan kekeruhan larutan Mc-Farland diinokulasikan ke dalam media secara aseptis, diinkubasi pada shaker 150 rpm pada kondisi gelap dengan suhu 30 o C selama 21 hari. Pertumbuhan isolat diamati setiap 7 hari sekali yaitu pada hari ke-0, ke-7, ke-14 dan hari ke-21 masa inkubasi. Pengukuran jumlah sel dilakukan dengan metode Standard Plate Count Fardiaz, 1992. Sebanyak 1 ml media biakan diencerkan hingga konsentrasi 10 -7 Alur kerja perhitungan pertumbuhan sel dapat dilihat pada Lampiran 4. halaman 35. , diinokulasikan ke media PCA secara aseptis dengan metode cawan sebar dan diinkubasi selama 24 jam. Jumlah koloni yang tumbuh dihitung dengan Colony counter. Untuk perhitungan estimasi jumlah sel dapat dihitung dengan rumus: Estimasi Jumlah Sel = Jumlah koloni x 1 Faktor Pengenceran CFU ml ⁄

3.3.4. Screening Aktivitas Biosurfaktan

Aktivitas biosurfaktan yang dihasilkan oleh isolat bakteri dilakukan dengan metode Drop Collapsing Test Jain et al., 1991 yang dimodifikasi. Isolat bakteri ditumbuhkan pada media BHB yang ditambah 2 dekstros. 2 ml inokulum cair isolat bakteri yang setara dengan kekeruhan larutan Mc-Farland ≈10 8 selml diinokulasikan ke dalam 100 ml media BHB yang mengandung 2 dekstros secara aseptis, diinkubasi pada shaker 150 rpm dengan kondisi gelap pada suhu 30 o C selama 15 hari. Setelah 15 hari masa inkubasi, masing-masing media biakan disaring dan diambil filtratnya. Sebanyak 4 ml filtrat media dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambah 4 ml N-heksan dan 2 ml akuades. Divorteks selama 10 detik, didiamkan selama 1 menit. Emulsi yang terbentuk diukur ketebalannya dengan jangka sorong, dikonversikan ke dalam volume. Alur kerja screening aktivitas biosurfaktan dapat dilihat pada Lampiran 5. halaman 36. 3.3.5 Uji Potensi Bakteri dalam Memproduksi Biosurfaktan 3.3.5.1 Penentuan Kurva Standar Biosurfaktan Penentuan kurva standar biosurfaktan dilakukan menggunakan rhamnosa murni dari Sigma Aldrich Company, Amerika Serikat. Rhamnosa dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda 0 blanko, 10, 50, 100 dan 200 ppm yang dilarutkan dengan larutan sodium bikarbonat NaHCO 3 Y= a + bX 0,05M, kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 2 ml. Masing-masing larutan tersebut ditambah 3,6 ml larutan orsinol, dipanaskan hingga mendidih, didinginkan pada temperatur kamar selama 15 menit dan dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 421 nm. Persamaan garis regresi kurva standar rhamnosa ditentukan dengan metode Least Square Glover Mitchell, 2002 dengan rumus: Dimana: a = intersep a = Y – bX b = slope koefisienregresi Y = absorbansi X = Konsentrasi Alur kerja pembuatan kurva standar rhamnosa dapat dilihat pada Lampiran 6. halaman 37.

3.3.5.2 Produksi Biosurfaktan

Bakteri ditumbuhkan pada media BHB yang mengandung karbosulfan sebagai sumber karbon. Inokulum cair isolat bakteri yang setara dengan larutan Mc-Farland sebanyak 2 ml diinokulasikan ke dalam media BHB yang mengandung karbosulfan, diinkubasi pada shaker 150 rpm dengan kondisi gelap dan suhu 30 o C selama 21 hari. Konsentrasi biosurfaktan yang terbentuk dianalisis dengan metode orsinol yang dimodifikasi Koch et al., 1991. Kultur bakteri yang telah diinkubasi disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit untuk memisahkan bakteri X - X n n b 2 2 ∑ ∑ ∑ ∑ ∑ − = Y X XY dengan media biakannya. Supernatan diambil 4 ml diekstrak dengan 2 ml diethylether selama 5 menit, ekstraksi diulangi sebanyak 3 kali. Lapisan ether diambil, dikeringkan dan dilarutkan kembali dalam 2 ml larutan sodium bikarbonat NaHCO 3 0,05 M. Kemudian larutan sampel divorteks dan ditambah 3,6 ml larutan orsinol, dipanaskan hingga mendidih, didinginkan pada temperatur kamar selama 15 menit dan dianalisis absorbansinya menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 421 nm. Alur kerja produksi biosurfaktan dapat dilihat pada Lampiran 7. halaman 38.

3.3.6 Uji Potensi Bakteri Penghasil Biosurfaktan Dalam Mendegradasi Karbosulfan

Uji potensi bakteri penghasil biosurfaktan dalam mendegradasi karbosulfan selama masa inkubasi dilakukan dengan menumbuhkan bakteri pada media mineral BHB yang mengandung 12 ppm karbosulfan. Sebanyak 20 ml inokulum cair isolat bakteri yang setara dengan kekeruhan larutan Mc-Farland diinokulasikan ke dalam 980 ml media secara aseptis, diinkubasi pada shaker pada kondisi gelap dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 30ºC selama 21 hari. Sampel sebanyak 300 ml dimasukkan dalam corong pisah, ditambahkan diklorometan sebanyak 100 ml. Sampel dan diklorometan diekstrak sehingga terbentuk dua fasa. Fasa organik ditampung dalam labu bulat. Pada air ditambahkan kembali diklorometan 50 ml. Siklus ini berlangsung sebanyak dua kali. Selanjutnya dilakukan evaporasi hingga hampir kering. Kemudian ditambahkan isooktan : toluen 9 : 1 sampai volume mencapai 3 ml. Dianalisis dengan menggunakan Kromatografi Gas Varian CP-3800 kolom ZB-1 30m x 0,25mm x 0,25µm dengan detector ECD, suhu kolom 200-270ºC, suhu detektor 300ºC, suhu injector 280ºC. Sampel diinjeksikan sebanyak 1 µl, diperoleh luas area, dikonversi ke dalam ppm. Alur kerja uji potensi bakteri penghasil biosurfaktan dalam mendegradasi karbosulfan dapat dilihat pada Lampiran 10. halaman 42. BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Karakteristik Bakteri Tanah Pertanian Berastagi Sumatera Utara

Hasil isolasi yang telah dilakukan diperoleh 16 isolat bakteri penghasil biosurfaktan yang ditumbuhkan pada media Bushnell-Hass Agar BHA yang mengandung 12 ppm karbosulfan merek dagang Marshal 200 EC sebagai sumber karbon Lampiran 14a. halaman 49. Isolat yang diperoleh yaitu 4 isolat dari tanah pertanian cabai, 3 isolat dari tanah pertanian jeruk, 5 isolat dari tanah pertanian kol, dan 4 isolat dari tanah pertanian tomat. Isolat bakteri ini memiliki karakteristik morfologi dan Gram yang bervariasi seperti yang terlihat pada Tabel 4.1.1 Tabel 4.1.1 Karakteristik Morfologi dan Pewarnaan Gram Bakteri Penghasil Biosurfaktan dari Tanah Pertanian Berastagi Isolat Bakteri Morfologi Koloni Morfologi sel Gram Bentuk Tepi Elevasi Warna Bentuk Penataan CBM 1 Irregular Entire Flat Putih Baccil Strepto, Stapilo - CBM 2 Irregular Undulate Flat Putih Cocobaccil Mono, diplo, strepto - CBM 3 Circular Entire Flat Putih susu Cocobaccil Mono, diplo, strepto - CBM 4 Circular Entire Flat Berpendar Baccil Mono, diplo - JBM 1 Circular Entire Flat Putih susu Baccil Strepto + JBM 2 Titik-titik Entire Flat Transparan Coccus Mono - JBM 3 Irregular Lobate Flat Transparan Coccus Mono, tetrad, Stapilo - KBM 1 Circular Entire Flat Putih susu Cocobaccil Mono, diplo, - KBM 2 Irregular Lobate Flat Transparan Coccus Strepto - KBM 3 Irregular Lobate Flat Berpendar Coccus Strepto - KBM 4 Titik-titik Entire Flat Transparan Coccus Strepto - KBM 5 Titik-titik Entire Flat Transparan Coccus Mono - TBM 1 Irregular Lobate Flat Putih susu Cocobaccil Mono, diplo - TBM 2 Circular Entire Flat Putih susu Baccil Mono, diplo - TBM 3 Circular Entire Flat Berpendar Cocobaccil Mono - TBM 4 Titik-titik Entire Flat Transparan Coccus Mono - CBM : Cabai Berastagi Marshal JBM : Jeruk Berastagi Marshal KBM : Kol Berastagi Marshal TBM : Tomat Berastagi Marshal Isolat yang diperoleh menunjukkan bentuk koloni circular bulat sebanyak 6 isolat, irregular tidak beraturan sebanyak 6 isolat dan titik-titik sebanyak 4 isolat, dimana tepi koloni berbentuk entire rata sebanyak 11 isolat, lobate berbelah sebanyak 4 isolat dan undulate berombak 1 isolat. Sedangkan elevasi koloni berbentuk flat. Koloni bakteri berwarna putih, putih susu, berpendar dan transparan. Bakteri yang diperoleh berbentuk coccus sebanyak 7 isolat, cocobaccil sebanyak 5 isolat dan baccil sebanyak 4 isolat. Bakteri yang diperoleh didominasi oleh bakteri Gram negatif sebanyak 15 isolat dan Gram positif 1 isolat isolat bakteri dapat dilihat pada Lampiran 14b. halaman 49. Panjaitan 2010 melakukan isolasi bakteri penghasil boisurfaktan dari laut Belawan dan memperoleh 13 isolat, Gram negatif sebanyak 10 isolat dan Gram positif 3 isolat. Karakterisasi sifat biokimia yang dilakukan meliputi uji hidrogen sulfida, uji sitrat, uji motilitas, uji pati, uji gelatin dan uji katalase menunjukkan bahwa seluruh isolat memiliki karakteristik yang berbeda seperti yang terlihat pada Tabel 4.1.2 gambar hasil uji biokimia dapat dilihat pada Lampiran 14c. halaman 50. Tabel 4.1.2 Karakteristik Biokimia Bakteri Penghasil Biosurfaktan Keterangan : + : positif - : negatif Isolat Bakteri Uji Biokimia Hidrolisa Pati Hidrolisa Gelatin Sitrat Hidrogen Sulfida fermentasi Gula Motilitas Katalase G lukos a Sukr os a Lak tos a E ndap a n H itam K e re tak an Med ia CBM 1 + + - - - - - - + + CBM 2 - + + - - - - - + - CBM 3 + + + + + + - - + + CBM 4 + - + + + + - - + - JBM 1 - - + + + + - + - + JBM 2 - + + + - - + - + + JBM 3 + - + + + + - + + + KBM 1 - - + + + + - + + + KBM 2 - - + + + + - - - + KBM 3 - - + + - - - + + + KBM 4 - + + - - - - - - + KBM 5 - - - - - - - - - + TBM 1 - + + + + + - + + + TBM 2 - - + + + + - + + + TBM 3 - - - - - - - - - - TBM 4 - - + + + + - + + + Menurut Lay 1994, identifikasi mikroba merupakan salah satu hal yang sangat penting. Identifikasi bakteri didasarkan pada morfologi, sifat biakan, sifat biokimiawi. Morfologi mikroorganisme berdasarkan bentuk, ukuran dan penataan biasanya tidak cukup untuk melakukan identifikasi. Ciri lainnya seperti sifat pewarnaan, pola pertumbuhan koloni, reaksi pertumbuhan pada karbohidrat, dan penggunaan asam amino sangat membantu dalam identifikasi mikroba.

4.2 Pertumbuhan Isolat