Desain Penelitian Teknik Pengumpulan Data

C. Populasi dan Sampel

Populasi dari penelitian ini adalah bakteri Bacillus cereus dan Escherichia coli yang diperoleh dari biakan di laboratorium Bioteknologi Universitas Gajah Mada Yogyakarta. Bakteri diidentifikasi terlebih dahulu dengan pengamatan morfologi koloni, pengamatan morfologi sel dan pengecatan gram. Sampel yang digunakan adalah herbaPhyllanthus niruri meniran yang diambil secara acak di kebun dan halaman laboratorium biologi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Herbadiekstraksi untuk mengeluarkan kompenan metabolit sekunder. Ekstraksi dilakukanmelalui dua cara, yaitu mengambil sari tanaman dengan cara menumbuk herba meniran tanpa diberi air dan dengan merebus herba dalam aquades.

D. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari hingga Mei 2014 di Laboratorium Biologi, Program Studi Pendidikan Biologi, Jurusan Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan, Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

E. Desain Penelitian

Penelitian dilakukan menggunakan metode penelitian rancangan acaklengkap Completely Randomized Design faktorial. Rancangan acak lengkap merupakan jenis rancangan percobaan yang paling sederhana. Satuan percobaan yang digunakan homogen atau tidak ada faktor lain yang mempengaruhi respon di luar faktor yang diuji atau diteliti. Faktor luar yang dapat mempengaruhi percobaan dapat dikontrol, misalnya percobaan dilakukan di rumah kaca atau laboratorium. Rancangan ini disebut rancangan acak lengkap, karena pengacakan perlakuan dilakukan pada seluruh unit percobaan. Rancangan acak lengkap digunakan bila faktor yang akan diteliti satu faktor atau lebih dari satu faktor Setiawan, 2009. Penelitian ini dilakukan dengan perlakuan variasi sampel dan konsentrasi ekstrak, dengan tiga kali ulangan pada setiap perlakuan. Sebagai kontrol positif digunakan larutan formaldehida, sedangkan kontrol negatif menggunakan aquades steril.

F. Teknik Pengumpulan Data

Penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan yaitu tahap persiapan, tahap pelaksanaan dan tahap perlakuan. Tahap persiapan merupakan tahap penyiapan alat dan bahan yang akan digunakan dalam penelitian. Tahap pelaksanaan terdiri dari pembuatan media uji Nutrient Agar NA, sterilisasi alat dan media, pembuatan ekstrak sampel, pembuatan standar McFarland, penyiapan mikroorganisme uji dan uji kemurnian mikroorganisme uji. Sedangkan tahap perlakuan terdiri atas uji aktivitas antibakteri,uji Kadar Hambat MinimalKHM dan uji Kadar Bunuh Minimal KBM. 1. Tahap Persiapan Pada tahap ini peneliti melakukan inventarisasi alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian dipinjam dari laboratorium biologi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Daftar alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat ada tabel 3.1 dan tabel 3.2. Tabel 3.1. Daftar Alat yang Digunakan No Nama alat Jumlah 1 Inkubator 1 unit 2 Autoklaf 1 unit 3 Pendingin kulkas 1 unit 4 Neraca analitik 1 buah 5 Rak tabung 2 buah 6 Tabung reaksi 20 buah 7 Gelas ukur 100 ml 1 buah 8 Gelas ukur 10 ml 1 buah 9 Pipet ukur 10 ml 2 buah 10 Pipet ukur 1 ml 2 buah 11 Gelas arloji 1 buah 12 Sendok tanduk 1 buah 13 Cawan petri 40 set 14 Jarum ose 2 buah 15 Erlenmeyer 250 ml 4 buah 16 Gelas beker 500 ml 2 buah 17 Vortex mixer 1 unit 18 Bunsen 2 buah 19 Sprayer alkohol 1 buah 20 Hot plate stirrer 1 unit 21 Pinset 2 buah 22 Magnetic stirrer 1 buah 23 Corong kaca 2 buah 24 Batang bengkok spreader 1 buah 25 Gelas beker 1 L 1 buah 26 Mortar dan stemper 1 pasang 27 Jangka sorong 1 buah 28 Pinset 2 buah 29 Penjepit tabung reaksi 2 buah 30 Batang pengaduk 2 buah 31 Kertas saring Secukupnya 32 Mikroskop 1 unit 33 Gelas benda 3 buah 34 Gelas penutup 3 buah 35 Microcam 1 unit 36 Kertas payung Secukupnya Tabel 3.2. Daftar Bahan yang Digunakan 37 Kapas Secukupnya 38 Kasa Secukupnya 39 Karet gelang Secukupnya 40 Plastik pembungkus Secukupnya 41 Cotton bud Secukupnya 42 Alumunium foil Secukupnya 43 Gelas beker 25 ml 8 buah 44 Marker 1 buah 45 Kertas label Secukupnya 46 Masker Secukupnya 47 Sarung tangan latex Secukupnya 48 Microbacterial safety cabinet 1 unit No Nama bahan Banyaknya 1 Biakan Bacillus cereus 1 tabung 2 Biakan Escherichia coli 1 tabung 3 Nutrient agar oxoid 200 gram 4 Aquades 5 liter 5 Alkohol 90 3 liter 6 Tinta China Secukupnya 7 Cat gram A,B,C,D Secukupnya 8 Minyak immersi Secukupnya 9 Barium klorida BaCl 1 10 ml 10 Asam belerang H 2 S 1 100 ml 11 Spiritus 1 liter 12 Herba meniran Secukupnya 13 Formalin Secukupnya 14 Natrium hipoklorit NaClO secukupnya Sampel herba meniranPhylantus niruridiambil dari kebun tanaman obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dan di beberapa tempat lain di sekitar laboratorium biologi Universitas Sanata Dharma. Tanaman meniran yang digunakan merupakan meniran hijau dengan tinggi sampel tanaman berkisar antara 20-50 cm. Seluruh bagian tumbuhan meniran digunakan dalam penelitian ini, mulai dari akar, batang, daun dan buah atau bunganya. Bakteri uji yang sudah didapat diperbanyak dengan cara melakukan teknik cawan gores pada media agar miring. 2. Tahap Pelaksanaan a. Pembuatan Ekstrak Terdapat dua perlakuan sampel untuk mendapatkan ekstrak. Perlakuan pertama ekstrak diperoleh melalui metode dekoksi.Metode dekoksi merupakan salah satu metode ekstraksi mengunakan pelarut air pada temperatur penangas air mendidih selama waktu tertentu minimal 30 menit dan temperatur sampai titik didih air BPOM, 2000. Penggunaan meniran sebagai obat diare dipaparkan oleh Latief 2012, yaitu dengan cara merebus 17 herba meniran seluruh bagian tanaman meniran, mulai dari akar, batang, daun dan buah atau bunga. Formula inilah yang kemudian dijadikan acuan banyaknya herba meniran yang akan digunakan dalam penelitian ini. Sebanyak 17 herba Phylantus niruridicuci menggunakan air mengalir hingga bersih, disterilkan dengan merendam herba dalam aquades yang diberi natrium hipoklorit NaClO selama 15 menit 10 ml natrium hipoklorit dimasukkan ke dalam 3 liter aquades, kemudian dibilas menggunakan aquades. Herba meniran dipotong-potong kemudian direbus dengan aquades sebanyak 3 gelas ±600 ml. Perebusan dilakukan selama minimal 30 menit, terhitung sejak pelarut aquades mulai mendidih. Hasil rebusan setelah mendidih disaring dan dapat digunakan dalam uji aktivitas antibakteri. Hasil saringan yang diperoleh merupakan ekstrak dengan konsentrasi 100. Perlakuan kedua herbaPhylantus nirurisegar ditumbuk dan diambil sarinya. Pencucian dan sterilisasi herba dilakukan dengan cara yang sama dengan perlakuan pertama. Kemudian herba dipotong-potong untuk mendapatkan ukuran yang lebih kecil sehingga memudahkan penumbukan. Selanjutnya herba ditumbuk atau dilumatkan menggunakan mortar dan stempar steril, kemudian disaring menggunakan kertas saring. Sari tanaman yang diperoleh merupakan ekstrak dengan konsentrasi 100. Setelah didapat stok ekstrak 100 dilakukan pengenceran ekstrak, masing-masing ekstrak diencerkan menjadi tiga konsentrasi, yaitu 35, 40 dan 45 dengan menambahkan aquades steril. Komposisi ekstrak dan aquades yang digunakan dalam pengenceran ekstrak dijelaskan dalam tabel 3.3. Tabel 3.3. Komposisi ekstrak dan aquades dalam pengenceran ekstrak Konsentrasi ekstrak yang diinginkan Volume sampel ekstrak ml Volume aquades ml Volume total ml 35 3,5 6,5 10 40 4 6 10 45 4,5 5,5 10 b. Pembuatan Media Uji Nutrient Agar NA Sebanyak 2,8 gram NA oxoid dilarutkan ke dalam 100 ml aquades, kemudian dipanaskan di atas hot plate stirrer. Pengadukan dilakukan dengan memasukkan magnetic stirrer ke dalam larutan. Larutan dipanaskan hingga NA larut dan didapatkan larutan berwarna kuning jernih. Media yang telah homogen kemudian bisa dibagi ke dalam dua atau tiga erlenmeyer lalu ditutup rapat dengan sumbat kapas dan selanjutnya disterilisasi. Setelah media disterilisasi kemudian dituang ke cawan petri atau tabung reaksi, sesuai dengan kebutuhan penelitian. Setelah media memadat kemudian diinkubasi dalam suhu ruang untuk melihat apakah media mengalami kontaminasi atau tidak, jika media tidak mengalami kontaminasi maka media dapat digunakan. c. Sterilisasi Alat dan Media Alat dan media yang digunakan dalam penelitian harus disterilkan terlebih dahulu dengan tujuan memperkecil peluang kontaminasi. Sterilisasi yang dilakukan yaitu sterilisasi panas bertekananyang dilakukan pada alat-alat berbahan kaca menggunakan autoklaf, sterlisasi dengan pemanasan dibakar dengan api untuk alat yang tidak tahan panas dan sterilisasi kimia menggunakan alkohol. Sterilisasi alat menggunakan autoklaf dilakukan pada tekanan 1 atm dan suhu 121˚C selama 15 menit. Bahan-bahan seperti media kultur dan aquades juga disterilisasi menggunakan autoklaf, namun waktu sterilisasi hanya 10 menit. Hal ini dilakukan untuk mencegah terjadinya kerusakan pada bahan media. d. Pembuatan Larutan Nefelometer McFarland Pembuatan larutan Nefelometer McFarland dilakukan dengan mencampurkan larutan asam belerang H 2 S 1 dan larutan barium klorida BaCl 1. Reaksi dari kedua larutan dengan konsentrasi yang berbeda-beda akan menghasilkan larutan dengan berbagai tingkat kekeruhan. Larutan-larutan ini dapat digunakan untuk menunjukkan kepadatan sel bakteri yang telah dilarutkan dalam cairan, dengan cara membandingkan tingkat kekeruhan warna. Dengan begitu peneliti dapat memperkirakan berapa jumlah sel bakteri yang akan diteliti. Kelemahan metode ini yaitu jumlah bakteri dalam suspensi cair tidak dapat diperkirakan dengan tepat karena hanya mengandalkan kemampuan mata melihat tingkat kekeruhan cairan. Sepuluh tabung reaksi bersih dengan ukuran yang sama disiapkan, dan diberi nomor pada masing-masing tabung. Lalu kedua larutan ini dicampurkan dalam tabung menggunakan pipet ukur dengan perbandingan volum yang terdapat pada tabel 3.4. Tabel 3.4. Perbandingan Konsentrasi Larutan dalam Pembutan Standar Mcfarland Nomor tabung 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 BaCl ml 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 H 2 S ml 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9 Setelah larutan dicampurkan, mulut tabung ditutup menggunakan alumunium foil dan disimpan. Suspensi barium sulfat yang terdapat dalam tabung-tabung ini kira-kira sama dengan sejumah suspensi sel bakteri per ml Bonang dan Enggar, 1982. e. Penyiapan Mikroorganisme Uji Pada mikroorganisme uji yang telah diperoleh dilakukan perbanyakan kultur murni. Kultur murni bakteri ujidiambil sedikit menggunakan jarum ose steril, kemudian digoreskan di atas permukaan medium NA miring secara aseptis. Setelah itu dilakukan inkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam. Meskipun sebenarnya bakteri dapat tumbuh pada rentang suhu 25-40 ˚C, namun suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri umumnya sekitar 37 ˚C Radji, 2010. Untuk mempersiapkanmikroorganisme uji yang akan digunakan dalam uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode cawan sebar spread plate. Biakan murni pada tabung reaksi diambil sebanyak satu ose lalu dimasukkan dalam tabung berisi 10 ml aquades steril kemudian dihomogenkan menggunakan vortex mixer. Dari tabung pertama ini diambil 1 ml suspensi bakteri uji dan dimasukkan dalam tabung kedua yang berisi 9 ml aquaqes steril, sehingga volume total tabung kedua adalah 10 ml. Demikian seterusnya hingga tabung yang ke lima pengenceran 10 -5 yang setara dengan 3.10 8 cfuml Nefelometer McFarland. Kemudian suspensi bakteri pengenceran 10 -5 diambil sebanyak 0,1 ml dan diteteskan ke dalam cawan petri berisi media NA kemudian diratakan menggunakan spreader atau batang drigalski secara aseptis. f. Pengamatan Morfologi Koloni dan Morfologi Sel Bakteri Uji. Mikroorganisme uji yang digunakan di dalam penelitian ini adalah Bacillus cereus dan Escherichia coli. Pada pengamatan morfologi koloni dan morfologi sel mikroorganisme uji, dilakukan langkah- langkah sebagai berikut: 1 Pengamatan Morfologi Koloni Mikroorganisme uji diambil sebanyak satu ose, kemudian diinokulasikan dengan teknik cawan gores streak plate pada medium NA dalam cawan petri. Selanjutnya kultur diinkubasi pada suhu 27 ˚C selama 24 jam, kemudian dilakukan pengamatan morfologi koloni mikroorganisme uji yang meliputi bentuk dan warna koloni. 2 Pengamatan Morfologi Sel Mikroorganisme uji diambil sebanyak satu ose, kemudian diinokulasikan secara goresan pada medium NA miring dan diinkubasi pada suhu 37 ˚C selama 24 jam. Morfologi sel mikroorganisme uji diamati dengan menggunakan pengecatan negatif, yaitu dengan cara membuat preparat apusan bakteri. Pertama-tama bersihkan permukaan gelas benda dengan alkohol, kemudian teteskan satu tetes tinta China di salah satu ujung gelas benda. Selanjutnya campurkan satu ose biakan bakteri dengan tinta China. Letakkan gelas benda yang lain di sisi campuran tinta dan biakan bakteri dalam posisi miring dengan sudut kemiringan 45º terhadap gelas benda pertama. Kemudian dorong gelas benda kedua ke arah sisi lainnya secara perlahan, sehingga tinta dan bakteri menyebar di permukaan gelas benda pertama. Selanjutnya angin anginkan apusan hingga kering dan dilakukan pengamatan dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran kuatAlexander dkk, 2003. 3 Pengecatan Gram Pengecatan gram dilakukan untuk mengetahui sifat Gram mikroorganisme uji. Pertama-tama, gelas benda dibersihkan dengan alkohol dan dipanaskan dengan bunsen sampai kering. Setelah itu, satu ose suspensi bakteri diambil secara aseptis dan diratakan seluas ± 1 cm pada gelas benda kemudian difiksasi dengan cara dilewatkan di atas apibunsen. Hal ini dilakukan untuk mematikan bakteri dan membuatnya menempel pada gelas benda tanpa merusak struktur sel bakteri. Objek yang sudah difiksasi kemudian ditetesi cat gram A kristal violet pada permukaan lapisan bakteri dan didiamkan selama 60 detik. Hasil pengecatan cat gram A dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Setelah kering, cat gram B iodine diteteskan dan didiamkan selama 60 detik, kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Selanjutnya dilakukan proses decolorisasi, yaitu objek diberi cat gram C alkohol dan didiamkan selama 15-30 detik, lalu kembali dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Kemudian, objek ditetesi dengan cat gram D safranin dan didiamkan selama 60 detik, kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Setelah kering, permukaan bakteri ditutup dengan gelas penutup kemudian ditetesi dengan minyak immersi secukupnya, kemudian ditutup dengan gelas penutup. Hasil diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat, setelah didapat gambar ditangkap menggunakan microcam. Jika sel bakteri tampak berwarna ungu maka hal ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri Gram-positif, namun jika berwarna merah, bakteri tesebut merupakan bakteri Gram-negatif Alexander dkk, 2003. 3. Tahap Perlakuan a. Uji Aktivitas Antibakteri Mikroorganisme uji yang sudah diinokulasi dengan teknik cawan tebar dalam cawan petri disiapkan tanpa melakukan inkubasi. Kemudian dari kedua jenis ekstrak masing-masing dibuat pengenceran konsentrasi ekstrak, yaitu 35, 40 dan 45. Sebelumnya peneliti telah melakukan penelitian uji aktivitas antibakteri dengan konsentrasi ekstrak 10, 20 dan 30, namun tidak menghasilkan zona hambat. Hal ini berarti ekstrak tidak dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Maka konsentrasi ekstrak ninaikkan menjadi 35, 40 dan 45. Selain ekstrak tanaman larutan kontrol juga disiapkan. Kontrol positif yang digunakan dalam penelitian ini adalah formaldehida atau formalin dalam bentuk cair. Penggunaan formalin sebagai kontrol positif dikarenakan formalin telah digunakan secara luas untuk mengawetkan spesimen biologis dan menonaktifkan bakteri dan virus Radji, 2009. Sedangkan sebagai kontrol negatif digunakan aquades yang telah disterilisasi, sehingga diyakini tidak mengandung mikroba ketika digunakan. Kertas saring bulat steril dicelupkan dalam tiap-tiap ekstrak dan larutan kontrol selama 15 menit, kemudian diletakkan pada media yang sudah diinokulasi dengan bakteri uji, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37˚C. Dalam satu cawan dibagi menjadi tiga daerah dan diisi dengan tiga kertas saring bulat, sehingga jika zona hambat terbentuk zona yang terbentuk di sekitar kertas saring satu tidak bertumpuk dengan zona kertas saring yang lain. Dalam penelitian ini dilakukan tiga kali pengulangan dalam setiap perlakuannya. Aktifitas antibakteri dilihat dari zona hambat yang terbentuk. Jika media di sekitar kertas saring tidak ditumbuhi bakteri menandakan ekstrak tanaman memiliki kandungan antibakteri. Jari-jari zona hambat diukur menggunakanjangka sorong, pengukuran dilakukan dari koloni bakteri yang berjarak terjauh dan koloni bakteri berjarak terdekat dengan kertas saring. Parameter untuk menilai efektivitas ekstrak terhadap bakteri Bacillus cereus dan Escherichia colidilihat melalui jari-jari zona penghambatan ekstrak dengan menggunakan rumus sebagai berikut: 2 q p r   Dimana: r : jari-jari zona hambat mm p : zona hambat terpanjang mm, dan q : zona hambat terpendek mm b. Uji Kadar Hambat Minimal KHM Konsentrasi terkecilekstrak yang memiliki kemampuan hambat yang telah didapatkan dari uji aktivitas digunakan sebagai acuan dalam menentukan konsentrasi sampel pada pengujian nilai Kadar Hambat Minimal KHM. Berdasarkan konsentrasi terendah yang menghambat bakteri ini, dibuat ekstrak dengan rentang yang lebih kecil dari rentang konsentrasi yang digunakan dalam pengujian aktivitas antibakteri. Misalkan pada uji aktivitas antibakteri, dari 3 konsentrasi ekstrak 5, 10, dan 15 konsentrasi terendah yang mampu menghasilkan zona bening adalah konsentrasi 10. Maka dalam uji KHM penggunaan konsentrasi ekstrak menjadi 10, 11, 12, dst. Dengan hal ini peneliti dapat mengetahui dengan pasti berapa konsentrasi ekstrak yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri. Pengujian dilakukan dengan metode dilusi padat. Metode ini dilakukan dengan menginokulasikan bakteri dengan teknik cawan tuang pourplate.M edia NA dengan suhu 45˚C dituangkan ke dalam cawan petri yang sudah berisi mikroorganisme uji dan sampel ekstrak. Jumlah media kultur yang digunakan sebanyak 10 ml, mikroorganisme uji pada konsentrasi 10 -8 cfuml yang divortex dahulu sebelum digunakan sebanyak 0,5 ml dan sampel ekstrak sebanyak 0,5 ml. Hasil pourplate diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37˚C. Penentuan nilai KHM dilihat dari konsentrasi terendah pada media yang tidak ditumbuhi bakteri. c. Uji Kadar Bunuh Minimal KBM Hasil yang telah didapat pada pengujian KHM digunakan dalam pengujian KBM dengan metode cawan gores strek plate. Cotton bud yang sudah disterilkan diusapkan ke permukaan media hasil KHM, kemudian digoreskan ke media steril yang baru lalu diinokulasi selama 24 jam pada suhu 37˚C. Jika media kultur yang digunakan tetap bening tidak ditumbuhi bakteri maka konsentrasi ini dapat ditetapkan sebagai nilai KBM. Penyediaan alat dan bahan sterilisasi Ekstraksi sampel meniran Pembuatan nefelometer McFarland Pembuatan media kultur Tumbuk Rebus Uji morfologi bakteri Peremajaan sel bakteri uji Perlakuan: Uji aktivitas antibakteri Kadar hambat minimum Kadar bunuh minimum Gambar 3.1. Diagram alir pelaksanaan penelitian Bagan alir tahapan pelaksanaan penelitian dapat dilihat pada gambar 3.1.

G. Instrumen Penelitian