21
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli sampai dengan Oktober 2010. Bertempat di Laboratorium Kultur Jaringan Pertanian Pusat Aplikasi Teknologi
Isotop dan Radiasi, Badan Tenaga Nuklir Nasional PATIR-BATAN Pasar Jumat, Jakarta Selatan.
3.2. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah Gamma Chamber 4000A, Laminar air flow 747 Bowman, timbangan Ohaus TP 200, Nouva II Stir Plate, Microwave
oven, pH meter Knick 765 Calimatic, autoklaf, ovenHeraeus, pipet ukur, labu ukur, botol kultur dengan tinggi 10 cm botol Nescafe, erlenmeyer 250 ml dan
500 ml, petri dish, bunsen, spatula, scalpel, pinset, bunsen, hand sprayer untuk alkohol, aluminium foil 7,6m x 450mm, tissu, karet gelang, label, rak kultur yang
dilengkapi lampu TL Philips 40 watt sebagai sumber penyinaran. Bahan-bahan yang digunakan adalah planlet Anggrek hibrid silangan dari
D. schullerii x May Neal Wrap, NH
4 2
SO
4,
KNO
3,
Cu
3
PO
4 2,
MgSO
4
. 7H
2
O, KH
2
PO
4,
stok A, stok B, stok C, stok D, stok Fe, mioinositol, piridoksin, tiamin, nikotin, glisin, Benzyl Amino Purine BAP, IAA, air kelapa, sukrosa gula pasir,
agar, arang aktif, akuades.
3.3. Cara Kerja
3.3.1. Sterilisasi alat-alat penanaman.
Alat-alat seperti botol kultur, pinset, gunting, cawan petri disterilisasi dengan menggunakan Oven pada suhu 180
o
C selama 2 jam.
3.3.2. Pembuatan Media Vacin dan Went VW
Pembuatan media VW secara umum adalah sebagai baerikut: 2,0 gr Ca
3
PO
4 2
; 5,25 gr KNO
3
; 2,5 gr KH
2
PO
4
; 2,5 gr MgSO
4
7H
2
O, 5 gr NH
4 2
SO
4,
dan vitamin Lampiran 1 dilarutkan dalam 500 ml akuades di labu ukur 1000 ml, kemudian ditambahkan gula 20 grl, arang aktif 2 grl dan agar 8 grl, BAP 5 ppm
dan air kelapa 150 ml. Kemudian ditambahkan akuades hingga volume 950 ml, lalu diaduk hingga homogen menggunakan magnetic stirrer dan spin bar. pH
media diatur hingga mencapai 5,8-6 dengan penambahan HCl dan NaOH, setelah itu ditambahkan akuades lagi sampai volume 1000 ml. Media dalam labu ukur
dipindahkan ke dalam 4 buah erlenmeyer 500 ml, ditutup dengan alumunium foil dan diikat dengan karet gelang. Kemudian media VW disterilisasi di autoclave
pada suhu 121
o
Cselama 1 jam + 15 menit. Media yang sudah steril disimpan di dalam ruang kultur sebelum digunakan.
3.3.3. Pembuatan media MS
Larutan stok yang termasuk larutan garam-garam anorganik dibuat dalam beberapa kelompok stok lampiran 2. Dari larutan stok, dimasukkan stok A
sebanyak 10 ml, stok B 10 ml, stok C 10 ml, stok D 5 ml, stok E 5 ml , stok F 5
ml, BAP 5 ppm, IAA 1 ppm ke dalam labu ukur berukuran 1000 ml yang telah berisi 400 ml akuades. Selanjutnya ditambahkan gula 20 gr, arang aktif 2 gr dan
bakto agar 8 gr, kemudian volume media ditambahkan akuades hingga volume 950 ml dan diaduk hingga homogen menggunakan magnetic stirrer dan spin bar.
Lalu pH media diatur hingga mencapai 5,8-6 dengan cara penambahan HCl dan NaOH. Media ditambah akuades hingga volume 1000 ml. Media dalam labu ukur
dipindahkan ke dalam 4 buah erlenmeyer 500 ml, ditutup dengan alumunium foil dan diikat dengan karet gelang. Kemudian media disterilisasi dengan autoclave
pada suhu 121
o
Cselama 1 jam + 15 menit. Media yang sudah steril disimpan di dalam ruang kultur sebelum digunakan.
3.3.4. Penuangan Media
Media dicairkan di dalam microwave, lalu dituang ke dalam botol kultur steril sesuai kebutuhan. Penuangan media dilakukan secara aseptik di Laminar Air
Flow Cabinet LAFC yang sebelumnya dibersihkan dengan alkohol 70 .
3.3.5. Iradiasi Planlet Dendrobium dan Penanaman
Planlet D. schulerii di dalam botol kultur diiradiasi sinar gamma menggunakan Gamma Chamber 4000 A Lampiran 3, dengan dosis 30 Gy, 60
Gy dan 90 Gy yang berisi masing-masing 30 planlet. Setelah selesai diiradiasi, planlet siap untuk ditanam dalam botol kultur yang berisi media VW. Planlet
ditanam mulai dari dosis yang paling rendah terlebih dahulu, yaitu 0 Gy kontrol, 30 Gy, 60 Gy dan terakhir 90 Gy. Planlet anggrek D. schulerii yang ada dalam
media sebelumnya dikeluarkan dari dalam botol dan diletakkan di cawan petri steril, lalu dibuang akarnya dan media yang masih menempel dengan
menggunakan pisau scalpel, kemudian ditanam dalam media perlakuan. Setiap botol kultur yang berisi media ditanam masing-masing satu planlet, dilakukan
sebanyak 30 botol. Setelah semua dosis ditanam, semua botol kultur tube disimpan di rak yang berada di ruang tumbuh dengan menggunakan penyinaran
lampu TL phillips 40 watt dan suhu 20-24 C.
3.3.6. Subkultur
Subkultur dilakukan setelah planlet berumur 6 minggu. Subkultur dilakukan dengan cara memindahkan planlet menggunakan pinset steril dari botol
kultur sebelumnya ke botol kultur yang baru. Jika planlet sudah membentuk tunas ataupun kalus, maka tunas atau kalus ditanam terpisah dalam botol yang baru dari
planlet induk. Dilakukan pengamatan subkultur selama 7 minggu, dengan pengamatan tinggi planlet dan jumlah akarnya.
3.4. Pengamatan
Pengamatan dilakukan setiap seminggu sekali mulai dari 1 minggu setelah tanam mst hingga tanaman berumur 11 minggu. Parameter yang diamati dan
diukur adalah :
1. Persentase planlet yang bertahan hidup
Persentase tumbuh eksplan yang hidup dihitung pada akhir pengamatan. Persentase tumbuh dihitung dengan rumus :
daya tumbuh = ∑ planlet yang hidup
x 100 ∑ eksplan yang ditanam
2. Tinggi planlet
Tinggi eksplan diukur dengan mengukur tinggi eksplan dari permukaan media sampai dengan ujung daun terpanjang. Pengukuran dilakukan dengan
menggunakan penggaris yang ditempel pada dinding botol kultur dimana tanaman tidak dikeluarkan dari botol kultur.
3. Pertambahan jumlah daun
Kriteria jumlah daun yang dihitung adalah semua daun yang tumbuh mulai kuncup daun sampai daun mekar dibagi jumlah planlet.
4. Jumlah tunas
Dihitung jumlah tunas yang terbentuk pada setiap minggu pengamatan dan mengamati ciri-ciri tunas yang terbentu dari setiap dosis.
5. Terbentuknya spot hijau kalus
Pengamatan ini dilakukan pada awal pertumbuhan dengan mengamati ciri-ciri terjadinya pembengkakkan pada eksplan.
3.5. Analisis Data
Kategori