4 3
2 1
4 3
2 1
A ctual Response
Ca lc
ul at
ed R
es po
ns e
PLS Response Plot
response is ctm 10 components
Gambar 12. Kurva hubungan antara kadar chlorpheniramine maleat sebenarnya actual response vs kadar terhitung calculated response guaifenesin
dengan metode spektrofotometri uv-
PLS pada λ 256 – 300 nm
C. Validasi model kalibrasi multivariat PLS
Salah satu kelemahan dari kalibrasi multivariat adalah dapat terjadi overfitting. Overfitting diartikan sebagai model yang tampak sempurna dengan nilai
korelasi yang tinggi dan kesalahan yang kecil tetapi model ini tidak dapat memberikan hasil yang baik jika diterapkan pada data lain yang berbeda dari bahan
atau sampel uji yang sama. Cara untuk mengatasi overfitting tersebut dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu dengan melakukan validasi eksternal dan validasi
internal Faber and Rajko, 2007. Pada penelitian ini dilakukan dua macam validasi, validasi internal dengan metode validasi silang menggunakan teknik leave one out
dan validasi eksternal dengan menyiapkan 10 campuran baku guaifenesin., dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat set validasi yang independen.
Validasi silang dengan teknik leave one out dilakukan dengan cara mengeluarkan satu data dari set kalibrasi. kemudian sisa sampel digunakan untuk
membuat persamaan. Kemudian persamaan yang sudah dibuat tadi digunakan untuk menghitung kadar terprediksi dari data yang sudah dikeluarkan sebelumnya. prosedur
ini dilakukan secara bergantian sampai semua sampel dari set kalibrasi dikeluarkan satu kali Faber and Rajko, 2007.
Selisih antara kadar prediksi dan kadar aktual dari setiap sampel dihitung. kemudian dihitung jumlah kuadrat dari selisih tadi yang disebut sebagai predicted
residual error sum of squares PRESS yang merupakan salah satu indikator kebaikan model yang menggambarkan kemampuan prediksi. Semakin rendah nilai
PRESS maka kemampuan model untuk memprediksi semakin baik Rohman and Che Man, 2011. Root mean squared error cross validation RMSECV juga
menggambarkan kemampuan prediksi. nilai RMSECV dapat ditentukan dari nilai PRESS, semakin kecil nilai RMSECV maka kemampuan model untuk memprediksi
semakin baik El-Gindy et al., 2006. Parameter RMSECV dihitung dengan menggunakan rumus:
El-Gindy et al., 2006. Dari validasi silang dapat juga ditentukan jumlah komponen yang
mencirikan data. Pada penelitian ini didapatkan 3 komponen untuk guaifenesin, 8 komponen untuk dextromethorphan HBr dan 10 komponen untuk chlorpheniramine
maleat. Semakin banyak persamaan spektra maka semakin sedikit jumlah komponen. sedangkan impurity dan noise akan menambah jumlah komponen Brereton, 2000.
Data dan parameter hasil validasi silang guaifenesin, dextromethorphan HBr dan
chlorpheniramine maleat dengan teknik leave one out dapat dilihat pada Gambar 13, 14 dan 15.
Hasil seleksi model validasi silang untuk guaifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat masing-masing adalah untuk nilai PRESS 37,93
µgmL, 3,36 µgmL dan 6,54 µgmL, sedangkan untuk nilai RMSECV 1,377 µgmL. 0,409 µgmL dan 0,571 µgmL. Nilai R
2
prediksi menunjukkan korelasi antara kandungan nilai aktual dan nilai prediksi. Semakin tinggi nilai prediksi mendekati 1
maka korelasi antara nilai aktual dan nilai prediksi semakin baik. Pada penelitian ini nilai R
2
prediksi yang dihasilkan untuk masing -masing senyawa adalah 0,9214 untuk guaifenesin, 0,9169 untuk dextromethorphan dan 0,6669 untuk chlorpheniramine
maleat. Dari hasil tersebut dapat dilihat bahwa nilai R
2
prediksi yang dihasilkan 0,999 yang mengindikasikan bahwa model ini mempunyai linieritas yang tidak bagus
sehingga sebenarnya tidak tepat digunakan untuk mengolah data. Profil kolerasi antara kadar prediksi dan kadar aktual guaifenesin, dextromethorphan HBr dan
chlorpheniramine maleat dengan validasi silang leave one out dapat dlihat pada gambar 16, 17 dan 18.
Gambar 13. Data dan parameter hasil validasi silang guaifenesin dengan teknik leave one out.
Gambar 14. Data dan parameter hasil validasi silang dextromethorphan HBr dengan teknik leave one out.
Gambar 15. Data dan parameter hasil validasi silang chlorpheniramine maleat dengan teknik leave one out.
30 25
20 15
10 30
25 20
15 10
Actual Response
C a
lc u
la te
d R
e sp
o n
se
Fitted C rossv al
Variable
PLS Response Plot
response is gg 3 components
Gambar 16. Kurva hubungan antara kadar guaifenesin sebenarnya actual response
vs kadar terhitung calculated respon hasil validasi silang leave one out dengan metode spektrofotometri UV-PLS
6 5
4 3
2 1
6 5
4 3
2 1
Actual Response
C a
lc u
la te
d R
e s
p o
n s
e
Fitted C rossv al
Variable
PLS Response Plot
response is dextro 8 components
Gambar 17. Kurva hubungan antara kadar dextromethorphan HBr sebenarnya actual response vs kadar terhitung calculated respon hasil validasi silang leave
one out dengan metode spektrofotometri UV-PLS
4 3
2 1
4 3
2 1
Actual Response
C a
lc u
la te
d R
e s
p o
n s
e
Fitted C rossv al
Variable
PLS Response Plot
response is ctm 10 components
Gambar 18. Kurva hubungan antara kadar chlopheniramine maleat sebenarnya actual response vs kadar terhitung calculated respon hasil validasi silang leave
one out dengan metode spektrofotometri UV-PLS
Konfirmasi kebaikan model kalibrasi PLS dilakukan juga dengan menggunakan validasi eksternal. Validasi ekternal dilakukan dengan cara menghitung
kadar prediksi dari set validasi yang terdiri dari 10 campuran sintetik seperti pada tabel 6. Nilai absorban yang diperoleh dihitung dengan menggunakan koefisien yang
diperoleh dari validasi silang sehingga didapatkan kadar prediksi.
Evaluasi untuk baik tidaknya data validasi eksternal dilakukan dengan menggunakan nilai R
2
, PRESS dan root mean square error of prediction RMSEP.
Semakin kecil nilai RMSEP menandakan bahwa prediksi terhadap konsentrasi sampel baru memiliki tingkat kesalahan yang semakin rendah.
Gambar 19. Kurva hubungan antara kadar guaifenesin sebenarnya actual response vs kadar terhitung calculated response hasil validasi eksternal dengan
metode spektrofotometri UV-
PLS pada λ 230 – 300 nm
y = 1.068x + 0.458 R² = 0.386
5 10
15 20
25 30
5 10
15 20
25
T e
rh it
u n
g ca
lc u
la te
d
Sebenarnya actual
kadar sebenernya vs terhitung Validasi Guaifenesin
Series1 Linear Series1
Gambar 20. Kurva hubungan antara kadar dextromethorphan HBr sebenarnya actual response vs kadar terhitung calculated response hasil validasi
eksternal dengan metode spektrofotometri UV-
PLS pada λ 230-300 nm
Gambar 21. Kurva hubungan antara kadar chlorpheniramine maleat sebenarnya actual response vs kadar terhitung calculated response hasil validasi
eksternal dengan metode spektrofotometri UV-PLS pada
λ 256-300 nm
y = 0.926x - 1.177 R² = 0.467
1 2
3 4
5 6
7 8
9
2 4
6 8
T e
rh it
u n
g ca
lc u
la te
d
Sebenarnya actual
Kadar sebenernya vs terhitung Validasi Dextromethorphan HBr
Series1 Linear Series1
y = 0.281x - 35.85 R² = 0.000
-60 -50
-40 -30
-20 -10
1 2
3 4
T e
rh it
u n
g ca
lc u
la te
d
Sebenarnya actual
Kadar sebenarnya vs terhitung Validasi Chlorpheniramine maleat
Series1 Linear Series1
Tabel 8. Nilai sebenarnya dan nilai terhitung hasil kalibrasi PLS dari sampel validasi eksternal yang mengandung guaifenesin, dextromethorphan HBr dan
chlorpheniramine maleat
Nomor Camp.
Konsentrasi µgmL Guaifenesin
Dextromethorpan HBr CTM
aktual Terhitung
aktual Terhitung
aktual Terhitung
1 17,0
15,300383 2,0
1,847649 0,5
-42,390088 2
18,6 21,1437729
4,6 3,316815
2,8 -46,208506
3 20,8
20,1447499 3,0
0,754452 1,0
-10,298850 4
17,5 19,4956614
5,2 2,999580
1,8 -43,296865
5 18,0
20,3434572 4,0
2,145172 2,0
-28,930556 6
21,6 22,4617063
2,8 1,989761
2,4 -47,828651
7 21,0
22,5764372 5,0
1,280067 3,0
-8,577519 8
19,0 21,2171612
3,4 2,236210
3,5 -44,101765
9 19,5
25,6386297 6,0
3,127794 1,4
-31,241890 10
20,0 22,5182777
6,5 7,908202
0,8 -50,286527
Persamaan : Persamaan :
Persamaan : y = 1,0687x + 0,4588
y = 0,9267x -1,1778 y = 0,2811x - 35,856
R
2
= 0,3862 R
2
= 0,4677 R
2
= 0,0003
RMSEP = 2,817 RMSEP = 2,136
RMSEP = 131,068 PRESS = 71,4132
PRESS = 41,0758 PRESS = 154610,6
Persamaan regresi yang dihasilkan untuk guaifenesin mempunyai nilai R
2
= 0,3862 dan nilai RMSEP = 2,817 µgmL untuk dextromethorphan HBr R
2
= 0,4677 dan nilai RMSEP = 2,136 µgmL, sedangkan untuk chlorpheniramine maleat R
2
= 0,0003 dan nilai RMSEP = 131,068 µgmL.
Dari hasil diatas dapat dilihat bahwa nilai R
2
mendekati 1 yang dihasilkan masih jauh mendekati 1 dan nilai RMSEP yang di dapat belum cukup rendah pada set
validasi ini dapat mengkonfirmasi bahwa model kalibrasi PLS dengan validasi silang
leave one out tidak sesuai digunakan untuk analisis guaifenesin, dextromethorphan HBr dan chlorpheniramine maleat.
Berdasarkan uraian di atas sudah dilakukan validasi model kalibrasi terhadap kriteria ketelitian dan ketepatan. Ketelitian dinyatakan dengan nilai presisi.
nilai presisi di deskripsikan dengan nilai RMSEC, RMSECV, RMSEP dan PRESS. Analisis RMSEC, RMSECV dan PRESS dilakukan pada sampel kalibrasi sedangkan
RMSEP dilakukan pada sampel validasi dimana semakin kecil nilainya maka semakin baik presisinya. Akurasi atau ketepatan dinyatakan dengan nilai koefisien
determinasi R
2
, semakin mendekati 1 berarti akurasinya tinggi. Selain itu, akurasi juga bisa dideskripsikan dengan persamaan garis y = bx + a, dimana x = kadar
sebenarnya dan y = kadar terprediksi. Jika nilai a mendekati 0 dan nilai b mendekati 1 maka akurasinya baik Danzer et al.. 2004.
Tabel 9. Rekapitulasi evaluasi parameter validasi metode spektrofotometri uv-kalibrasi multivariat PLS
Tahap Parameter validasi
GG Dextro
CTM Kalibrasi
RMSEC 0,130
0,027 0,049
R
2
0,9993 0,9997
0,9976 a
0,0131 0,0001
0,0057 b
0,9993 0,9997
0,9976 Validasi
1.Internal validasi silang RMSECV
1,377 0,409
0,571 R
2
0,9214 0,9169
0,6669 PRESS
37,93 3,36
6,54 a
b 2. Eksternal
RMSEP 2,817
2,136 131,068
R
2
0,3862 0,4677
0,0003 PRESS
7,144,132 410,758
154610,6 a
0,4588 -11,778
-35,856 b
10,687 0,9267
0.2811
Melihat parameter yang dihasilkan dari uji validasi silang maupun validasi eksternal yang sudah dilakukan dapat disimpulkan bahwa model ini tidak baik dan
tidak sesuai digunakan untuk melakukan penetapan kadar dalam sampel sediaan farmasi.
D. Penetapan kadar sampel sediaan farmasi
