Hemositometer terdiri dari 4 kamar hitung A, B, C, dan D, setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak. Hitung sel pada 4 kamar hemositometer, sel yang
gelap mati dan sel yang berada dibatas luar di sebelah kiri dan atas tidak ikut dihitung. Sel dibatas kanan dan bawah ikut dihitung. Hitung jumlah sel per ml
dengan rumus: Σ selml = Σ sel A + Σ sel B + Σ sel C + Σ sel Dx 10
4
4 Hitung jumlah total sel yang diperlukan.
Misal: untuk menanam sel pada tiap sumuran 96-well plate maka jumlah total sel yang diperlukan adalah 1x10
4
sumuran x 100 sumuran dibuat lebih : 1x 10
6
Hitung volume panenan sel yang diperlukan dalam mL dengan rumus: Volume panenan sel = Jumlah total sel yang diperlukan
Jumlah sel terhitung ml
Ambil volume panenan sel, transfer ke tabung konikel baru kemudian tambahkan MK sampai total volume yang diperlukanHansen, 2013.
3.11 Pembuatan Konsentrasi Larutan Uji
Ekstrak sampel uji ditimbang sebanyak 50 mg dalam polytube, kemudian dilarutkan dalam dimetilsulfoksida DMSO sebanyak 1000 µl, di vortex agar
sampel terlarut sempurna kemudian di cukupkan dengan MK, kemudian dibuat
Universitas Sumatera Utara
pengenceran selanjutnya sampai diperoleh larutan uji dengan konsentrasi 500 µgml, 250 µgml, 125 µgml, 62,5 µgml, dan 31,25 µgml semua pengenceran
dilakukan dengan menggunakan MK.
3.12 Pengujian Sitotoksik
Sel uji ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga diperoleh kepadatan 1 x 10
4
selsumuran dan diinkubasi dalam inkubator CO
2
5 bersuhu 37
º
C selama 24 jam untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik. Setelah itu medium diganti dengan yang baru kemudian ditambahkan ekstrak sampel uji
berbagai konsentrasi dengan co-solvent DMSO Sigma dan diinkubasi pada 37ºC dalam inkubator CO
2
5 selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media dan ekstrak dibuang kemudian sel dicuci dengan PBS Sigma. Pada masing-masing
sumuran, ditambahkan 100μL media kulturDMEM dan 10μL MTT Sigma konsentrasi 5 mgmL. Sel diinkubasi kembali selama 4-6 jam dalam inkubator
CO
2
5 bersuhu 37ºC. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper SDS 10 dalam HCl 0,01 N, lalu plate dibungkus agar tidak tembus cahaya dan dibiarkan
selama satu malam pada suhu kamar, kemudian sel di shaker selama 10 menit. Serapan dibaca dengan ELISA reader Bencmark Bio Rad pada panjang
gelombang 595 nm Adina, 2009.
3.13 Analisis Hasil
Data absorbansi yang diperoleh dari uji sitotoksik, sel dikonversi ke dalam persen sel hidup. Persen sel hidup dihitung menggunakan rumus:
Hidup = Absorbsi sel dengan perlakuan – Absorbansi mediax 100 Absorbansi kontrol Sel – Absorbansi kontrol media
Universitas Sumatera Utara
Kemudian dianalisis dianalisis dengan program SPSS 17. Aktivitas sitotoksik dinyatakan dalam IC
50
konsentrasi yang menyebabkan kematian 50 populasi sel Satria, 2012.
3.14 Uji kombinasi
Metode yang umum digunakan untuk mengevaluasi kombinasi obat adalah Isobologram dan Combination Index CI.
CI= D
1
Dx
1
+ D
2
Dx
2
Dx : konsentrasi satu senyawa tunggal yang dibutuhkan untuk memberikan efek sebesar efek kombinasi, yaitu IC50 terhadap pertumbuhan sel kanker payudara
D1 dan D2: besarnya konsentrasi kedua senyawa untuk memberikan efek yang sama.
Huruf indeks kombinasi CI yang diperoleh diinterpretasikan seperti pada Tabel 1 Reynolds, et al., 2005.
Tabel 3.1. Interpretasi nilai CI Combination Index
Kultul sel ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga di peroleh kepadatan jumlah sel adalah 1x10
4
selsumuran. Transfer sel ke dalam sumuran, masing-masing 100 µl. Disisakan 2 sumuran kosonguntuk kontrol media dan
kontrol sel. Diamati keadaan sel di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Inkubasi sel di dalam inkubator selama 24 jam. Setelah sel normal kembali, segera
buat seri konsentrasi sampel dan agen kemoterapi Doxorubicin untuk perlakuan.
CI Interpretasi CI Interpretasi
0,1 sinergis sangat kuat 0,1–0,3
sinergis kuat 0,3–0,7
sinergis 0,7–0,9
sinergis ringan-sedang 0,9–1,1
mendekati additif 1,1–1,45 antagonis ringan-sedang
1,45–3,3 antagonis 3,3 antagonis kuat-sangat kuat
Universitas Sumatera Utara
Seri konsentrasi ekstrak terdiri dari 4 konsentrasi: ½ IC
50
,
3 8
IC
50
, ¼ IC
50
,dan
1 8
IC
50
. Seri konsentrasi doxorubicin terdiri dari 4 konsentrasi: ½ IC
50
,
1 8
IC
50
, ¼ IC
50
,dan
1 16
IC
50
. Diambil plate yang telah berisi sel dari inkubator. Buang media sel dengan cara balikkan plate 180ºC di atas tempat buangan, kemudian tekan
plate secara perlahan di atas tisu makan untuk meniriskan sisa cairan. Cuci sel dalam sumuran dengan masing-masing 100 µl PBS. Buang PBS, tiriskan sisa
cairan dengan tisu. Untuk kelompok perlakuan kombinasi:
Dimasukkan seri konsentrasi ekstrak sampel ke dalam sumuran 50 µl dengan replikasi 3 kali triplo, kemudian tambahkan seri konsentrasi Doxorubicin
untuk kombinasi 50 µl. Untuk kelompok perlakuan tunggal:
Dimasukkan seri konsentrasi sampel atau agen kemoterapi ke dalam sumuran 50 µl dengan replikasi 3 kali triplo, kemudian tambahkan MK 50
µl ke dalam sumuran. Untuk kontrol sel:
Ditambahkan MK ke dalam sumuran yang berisi sel 100 µl dengan replikasi 3 kali triplo.
Untuk kontrol media: Ditambahkan MK ke dalam sumuran yang kosong tanpa sel 100 µl
dengan replikasi 3 kali triplo. Diinkubasi di dalam inkubator CO
2
. Lama inkubasi tergantung pada efek perlakuan terhadap sel. Jika dalam waktu 24 jam
belum terlihat efek sitotoksik, inkubasi kembali selama 24 jam waktu inkubasi total 24-48 jam. Pada akhir inkubasi, media dan ekstrak dibuang kemudian sel di
cuci dengan PBS Sigma. Tambahkan 100 µl media kultur DMEM dan 10 µl
Universitas Sumatera Utara
reagen MTT ke setiap sumuran, termasuk kontrol media tanpa sel. Inkubasi sel selama 2-4 jam di dalam inkubator sampai terbentuk kristal formazan yang ungu.
Setelah 2-4 jam, periksa kondisi sel dengan mikroskop inverted. Jika formazan telah jelas terbentuk, tambahkan stopper SDS 10 dalam HCl 0,1 N. Bungkus
plate dengan kertas atau alumunium foil dan inkubasikan di tempat gelap dan suhu kamar selama semalam. Keesokan harinya, plate di-shaker selama 10 menit
untuk melarutkan formazan. Hidupkan ELISA reader, tunggu proses progressing hingga selesai. Buka pembungkus plate dan tutup plate. Masukkan ke dalam
ELISA reader. Baca absorbansi masing-masing sumuran dengan ELISA reader dengan panjang gelombang 550-600 nm
ƛ= 595 nm dengan cara tekan tombol START. Setelah semua sumuran dibaca, tekan tombol STOP, dan matikan ELISA
reader. Setiap kali pembacaan di ELISA reader, catat di buku catatan pemakaian ELISA reader. Hitung prosentase sel hidup akibat perlakuan. Lihat Analisis dan
Interpretasi Data kombinasi senyawa. Hitung harga CI Combination Index Nugroho, et al., 2012
3.15 Pengujian Apoptosis
