L steril. Lakukan proses penyaringan dengan menggunakan filter, aliquot media ditampung dalam botol duran 500 ml, diberi identitas pada botol media nama
media, tanggal pembuatan, expire date, nama pembuat. Media disimpan pada suhu 2-8
o
C Handayani, et al., 2001.
3.9.4 Pembuatan Media MK-M199
Komposisi :Foetal BovineSerum FBS 10
Penisilin-streptomisin 3
Fungison 1.
M199 ad 100 ml
Cara Pembuatan : Campur semua bahan di atas, dan dilakukan di dalam LAF Laminar Air Flow,
beri identitas pada botol MK nama media, tanggal pembuatan, expire date, dan nama pembuat, simpan pada suhu 2-8
o
C Handayani, et al., 2001.
3.10 Penumbuhan Sel
3.10.1 Penumbuhan sel MCF-7
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, ambil 10 ml media DMEM pada tabung konikel 15 ml, ambil ampul sel MCF-7 dari freezer -
80
o
C atau tangki nitrogen dan cairkan pada suhu kamar, ambil suspensi sel dalam ampul, masukkan tetes demi tetes kedalam media DMEM yang telah disiapkan,
sentrifuge pada 600 rpm selama 5 menit, buang supernatan dan tambahkan 4 ml MK-DMEM dan resuspensi hingga homogen. Transfer masing-masing 2 ml ke
dalam flask kultur baru. Tambahkan 5 ml MK-DMEM ke dalam masing-masing flask kultur, dan homogenkan. Amati kondisi sel dengan menggunakan
mikroskopinverted. Pastikan sel homogen pada seluruh permukaan flask kultur
Universitas Sumatera Utara
tidak menggerombol pada bagian tertentu. Beri identitas pada flask kultur, kemudian simpan dalam inkubator CO
2.
3.10.2 Penumbuhan Sel T47D
Alat dipersiapkan dan bahan dikondisikan pada suhu ruangan, lalu diambil 10 ml media DMEM pada tabung konikel. Diambil ampul dari freezer -80
o
C atau tangki nitrogen, lalu dicairkan pada suhu kamar.Diambil suspensi sel dalam ampul
dan dimasukkan tetes demi tetes kedalam media DMEM yang telah disiapkan.Disentrifuge pada 600 rpm selama 5 menit, supernatan dibuang dan
ditambahkan 4 ml MK DMEM dan resuspensi hingga homogen. Ditransfer masing-masing 2 ml ke dalam flask kultur baru. Ditambahkan 5 ml MK ke dalam
masing-masing flask kultur dan homogenkan. Kondisi sel diamati dengan menggunakan mikroskop inverted. Sel dipastikan homogen pada seluruh
permukaan flask kultur tidak menggerombol pada bagian tertentu. Beri identitas pada flask kultur, kemudian simpan dalam inkubator CO
2
.
3.10.3 Penumbuhan sel Vero
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, ambil 10 ml media M199 pada tabung konikel, ambil ampul dari freezer -80
o
C sel vero atau tangki nitrogen dan cairkan pada suhu kamar, ambil suspensi sel dalam ampul,
masukkan tetes demi tetes kedalam media M199 yang telah disiapkan, sentrifuge pada 600 rpm selama 5 menit, buang supernatan dan tambahkan 4 ml MK-M199
dan resuspensi hingga homogen. Transfer masing-masing 2 ml ke dalam flask kultur baru. Tambahkan 5 ml MK-M199 ke dalam masing-masing flask kultur,
dan homogenkan. Amati kondisi sel dengan menggunakan mikroskop inverted. Pastikan sel homogen pada seluruh permukaan flask kultur tidak menggerombol
Universitas Sumatera Utara
pada bagian tertentu. Beri identitas pada flask kultur, kemudian simpan dalam inkubator CO
2
Handayani, et al., 2001.
3.10.4 Subkultur Sel
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, lakukan pengerjaan pada LAF. Lakukan proses panen seldengan cara mengambil 500 µl
panenan sel dan masukkan ke dalam flask kultur. Tambahkan 6 ml MK, homogenkan. Inkubasi sel pada inkubator CO
2
, amati kondisi sel pada keesokan harinya.
3.10.5 Panen Sel
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, amati kondisi sel. Panen dilakukan apabila sel telah dalam kondisi 80 konfluen, semua
pekerjaan dilakukan pada LAF. Buang MK-DMEM sel MCF-7 dan sel T47D dan MK-M199 sel Vero dari masing-masing flask dengan mikropipet atau pipet
pasteur, cuci sel 2 kali dengan 5 ml PBS Phosphate Buffer Salin, tambahkan 400 µl Tripsin-EDTA 0,25 secara merata, kemudian inkubasi di dalam inkubator
CO
2
selama ± 5 menit, dan tambahkan 4 ml MK untuk menginaktifkan tripsin. Resuspensi sel dengan mikropipet agar sel terlepas satu-satu tidak
menggerombol. Amati keadaan sel di mikroskop inverted. Resuspensi sel kembali jikamasih ada sel yang menggerombol. Transfer sel ke dalam tabung
konikelHandayani, et al., 2001.
3.10.6 Penghitungan sel MCF-7, sel T47D dan sel Vero
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, ambil 10 µl panenan sel dan pipetkan ke dalam hemositometer. Hitung jumlah sel dibawah
mikroskop dengan menggunakan counter.
Universitas Sumatera Utara
Hemositometer terdiri dari 4 kamar hitung A, B, C, dan D, setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak. Hitung sel pada 4 kamar hemositometer, sel yang
gelap mati dan sel yang berada dibatas luar di sebelah kiri dan atas tidak ikut dihitung. Sel dibatas kanan dan bawah ikut dihitung. Hitung jumlah sel per ml
dengan rumus: Σ selml = Σ sel A + Σ sel B + Σ sel C + Σ sel Dx 10
4
4 Hitung jumlah total sel yang diperlukan.
Misal: untuk menanam sel pada tiap sumuran 96-well plate maka jumlah total sel yang diperlukan adalah 1x10
4
sumuran x 100 sumuran dibuat lebih : 1x 10
6
Hitung volume panenan sel yang diperlukan dalam mL dengan rumus: Volume panenan sel = Jumlah total sel yang diperlukan
Jumlah sel terhitung ml
Ambil volume panenan sel, transfer ke tabung konikel baru kemudian tambahkan MK sampai total volume yang diperlukanHansen, 2013.
3.11 Pembuatan Konsentrasi Larutan Uji
