reagen MTT ke setiap sumuran, termasuk kontrol media tanpa sel. Inkubasi sel selama 2-4 jam di dalam inkubator sampai terbentuk kristal formazan yang ungu.
Setelah 2-4 jam, periksa kondisi sel dengan mikroskop inverted. Jika formazan telah jelas terbentuk, tambahkan stopper SDS 10 dalam HCl 0,1 N. Bungkus
plate dengan kertas atau alumunium foil dan inkubasikan di tempat gelap dan suhu kamar selama semalam. Keesokan harinya, plate di-shaker selama 10 menit
untuk melarutkan formazan. Hidupkan ELISA reader, tunggu proses progressing hingga selesai. Buka pembungkus plate dan tutup plate. Masukkan ke dalam
ELISA reader. Baca absorbansi masing-masing sumuran dengan ELISA reader dengan panjang gelombang 550-600 nm
ƛ= 595 nm dengan cara tekan tombol START. Setelah semua sumuran dibaca, tekan tombol STOP, dan matikan ELISA
reader. Setiap kali pembacaan di ELISA reader, catat di buku catatan pemakaian ELISA reader. Hitung prosentase sel hidup akibat perlakuan. Lihat Analisis dan
Interpretasi Data kombinasi senyawa. Hitung harga CI Combination Index Nugroho, et al., 2012
3.15 Pengujian Apoptosis
Metode yang digunakan adalah metodeFlowcytometri.Jumlah sel yang dibutuhkan untuk uji apoptosis adalah sebanyak 5x10
5
selsumuran yang kemudian ditanam pada microplate 6 sumuran, lalu diinkubasi selama 24 jam. Keesokan
harinya sel ditambahkan sampel uji lalu diinkubasi kembali selama 24 jam. Kemudian diambil media pada masing-masing sumuran pada tiap konsentrasi lalu
dimasukkan dalam tabung konikel 15 ml lalu media dicuci dengan PBS 1x dan ditampung pada konikel yang sama. Ditambahkan tripsin 250 µl pada tiap
sumuran lalu diinkubasi selama 3 menit pada suhu 37ºC pastikan di bawah
Universitas Sumatera Utara
mikroskop sel tidak menggerombol satu sama lain untuk mendapatkan hasil yang maksimal. Setelah itu ditambahkan 1 ml media kultur lalu media ditampung pada
tabung konikel 15 ml. Disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 5 menit dan supernatannya dibuang. Lalu ditambahkan sebanyak 1 ml PBS kemudian
media dipindahkan ke dalam tabung konikel 1,5 ml dan disentrifugasi lagi dengan kecepatan 2000 rpm selama 3 menit, setelah itu supernatannya dibuang.
Kemudian ditambahkan aneksin dan diukur dengan alat flowcytometer Hostanska, et al., 2004.
3.16 Pengujian Sel Vero Selectivity Index
Sel ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga diperoleh kepadatan 1 x 10
4
selsumuran dan diinkubasi selama 24 jam untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik. Setelah itu medium diganti dengan yang baru kemudian ditambahkan
ekstrak ekstrak pada berbagai konsentrasi dengan cosolvent DMSO Sigma dan diinkubasi pada 37ºC dalam inkubator CO
2
5 selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media dan ekstrak dibuang kemudian sel dicuci dengan PBS Sigma.
Pada masing- masing sumuran, ditambahkan 100μL media kultur dan 10μL MTT
Sigma 5 mgmL. Sel diinkubasi kembali selama 4-6 jam dalam inkubator CO
2
5, 37ºC. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen stopper SDS 10 dalam HCl 0,01 N, plate dibungkus agar tidak tembus cahaya dan dibiarkan selama satu
malam. Serapan dibaca dengan ELISA reader Bencmark Bio Rad pada panjang gelombang 595 nm Nugroho, et al., 2012.
Selektivity index dihitung menggunakan persamaan di bawah ini: Selectivity Index = IC50 Sel Vero
IC50 Sel Uji
Universitas Sumatera Utara
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan
Hasil identifikasi tumbuhan yang dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani Pusat, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan
Indonesia LIPI Bogor menunjukkan bahwa sampel termasuk suku Rutaceae, spesies Zanthoxylum acanthopodium DC. Hasil identifikasi dan gambar tumbuhan
dapat dilihat pada Lampiran 1 dan Lampiran 2. Halaman 85 dan 86 .
4.2 Hasil Karakterisasi Simplisia dan Ekstrak 4.2.1 Pemeriksaan makroskopik
Hasil pemeriksaan makroskopik dari buah andaliman diperoleh bahwa buah muda berwarna hijau, dan matang berwarna merah tua sampai merah
kecoklatan, bila dipetik warnanya cepat berubah menjadi hitam. Bentuk buah bulat dan kecil, lebih kecil dari merica, bila digigit mengeluarkan aroma wangi
dan rasa tajam yang khas, dan dapat merangsang produksi air liur. Biji berada dalam buah dan keras. Pemeriksaan makroskopik yang dilakukan terhadap
simplisia buah andaliman yaitu simplisia berwarna hitam, berbau khas, dan biji keluar dari buah. Pemeriksaan karakteristik buah andaliman secara makroskopik
dilakukan untuk memperoleh identitas simplisia. Hasil pemeriksaan makroskopik simplisia buah andaliman dapat dilihat pada Lampiran3 dan 4, Halaman 87 dan
88.
Universitas Sumatera Utara
4.2.2 Pemeriksaan mikroskopik serbuk simplisia
Hasil pemeriksaan mikroskopik dari serbuk simplisia buah andaliman memperlihatkan adanya epidermis, rambut biasa, sel rambut yang kolaps, kelenjar
minyak, dan parenkim epidermis kulit biji berwarna jingga kemerahan. Lampiran 5 halaman 89.
4.2.3 Hasil pemeriksaan karakteristik serbuk simplisia
Hasil pemeriksaan karakteristik serbuk simplisia secara mikroskopik terlihat adanya fragmen pengenal berupa trichoma, berkas pembuluh, kristal
kalsium oksalat bentuk prisma. Menurut Depkes 2000, standarisasi suatu simplisia dan ekstrak merupakan pemenuhan terhadap persyaratan sebagai bahan
obat dan menjadi penetapan nilai untuk berbagai parameter produk. Beberapa karakterisasi yang dilakukan masing-masing memberikan tujuan sehingga
diharapkan memenuhi persyaratan simplisia sebagai bahan baku obat. Hasil pemeriksaan karakterisasi simplisia dan ekstrak n-heksan, ekstrak etilasetat serta
ekstrak etanol dari buahandaliman terlihat pada Tabel 4.1 berikut.
Tabel 4.1 Hasil karakterisasi simplisia dan ekstrak buah andaliman Zanthoxylum
acanthopodium DC
No Uraian
Simplisia ENHBA
EEABA EEBA
Kadar air 6,65
4,96 4,93
7,40 Kadar sari yang larut air
9,90 0,89
11,16 73,69 Kadar sari yang larut etanol
19,46 4,04
76,79 85,68 Kadar abu total
4,85 0,24
0,63 1,12
Kadar abu yang tidak larut asam 0,26 0,03
0,07 0,28
Hasil pemeriksaan kadar air serbuk simplisia, ekstrak n-heksan, etilasetat dan etanol buah andaliman diperoleh 6,65, 4,96, 4,93, dan 7,40.
Universitas Sumatera Utara
Hasil penetapan kadar air simplisia dari buah andaliman memenuhi persyaratan dari buku Materia Medika Indonesia yaitu tidak melebihi 10
DEPKES, 1995.Ekstrak kental secara umum memenuhi persyaratan yaitu tidak melebihi 30 Voigt, 1994. Penetapan kadar air dilakukan untuk memberikan
batasan minimal kandungan air yang masih dapat ditolerir di dalam simplisia dan ekstrak karena tingginya kandungan air menyebabkan ketidakstabilan sediaan
obat, pertumbuhan bakteri dan jamur cepat tumbuh dan bahan aktif yang terkandung didalamnya dapat terurai dan kadar air yang melebihi 30 dapat
menjadi media yang baik untuk pertumbuhan jamur. Perubahan senyawa kimia berkhasiat akibat aktivitas enzim karena enzim tertentu dalam sel masih dapat
bekerja menguraikan senyawa aktif setelah sel mati dan selama ekstrak masih mengandung jumlah air tertentu.
Hasil penetapan senyawa yang larut air dari simplisia dan ekstrak n- heksan, etilasetat dan etanol buah andaliman di peroleh 9,90, 0,89, 11,16,
73,69. Senyawa-senyawa yang dapat larut dalam air adalah glikosida, gula, gom, protein, enzim, zat warna dan asam organik. Karakteristik dari serbuk
simplisia buah andaliman tidak tercantum di buku Materia Medika Indonesia. Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol dari simplisia dan ekstrak n-heksan,
etilasetat dan etanol buah andaliman di peroleh 19,46, 4,04, 76,79, 85,68 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol digunakan untuk mengetahui kadar
sari yang larut dalam pelarut polar. Senyawa-senyawa yang dapat larut dalam etanol adalah glikosida, antrakinon, steroid, alkoloid, flavonoid, klorofil, dan
dalam jumlah sedikit yang larut yaitu lemak dan saponin Depkes RI, 1986. Penetapan kadar abu dan total dan kadar abu tidak larut asam dari serbuk simplisia
dan ekstrak n-heksan, etilasetat dan etanol buah andaliman di peroleh 4,85,
Universitas Sumatera Utara
0,24, 0,63, 1,12 dan 0,26, 0,032, 0,073 dan 0,28 Tujuan penetapan kadar abu total dan kadar abu tidak larut asam adalah untuk memberikan
gambaran kandungan mineral internal dan eksternal yang berasal dari proses awal sampai terbentuknya simplisia dan ekstrak Depkes, 2000.Zat-zat ini dapat
berasal dari senyawa oksida-oksida anorganik. Kadar abu total yang tinggi menunjukkan adanya zat anorganik logam-logam Ca, Mg, Fe, Cd dan Pb yang
sebahagian mungkin berasal dari pengotor. Kadar logam berat yang tinggi dapat membahayakan kesehatan, oleh sebab itu perlu dilakukan penetapan kadar abu
total dan kadar abu tidak larut asam untuk memberikan jaminan bahwa ekstrak tidak mengandung logam berat tertentu melebihi nilai yang ditetapkan karena
berbahaya toksik bagi kesehatan.
4.2.4 Pemeriksaan profil KLT terhadap ekstrak etilasetat buah andaliman
Kromatografi lapis tipis KLT merupakan salah satu metode untuk mengetahui jumlah komponen dan untuk menegaskan hasil yang didapat dari
skrining fitokimia dalam sampel. Hasil pemeriksaan KLT terhadapEEABA ekstrak etil asetat buah andaliman diperoleh
pengembang terbaik
adalahetilasetat:n-heksan 8:2.Ekstrak ditotolkan pada plat KLT dan diletakkan ke dalam chamber yang telah dijenuhkan. Setelah pelarut mencapai batas akhir
penotolan BAP plat diangkat, dikeringakan dan disemprot dengan pereaksidragendorf akan menunjukkan bercak coklat jingga berlatar kuning
Harborne, 1987. Timbulnya lima noda dengan Rf0,10kuning 0,13 kuning 0,20 hijau 0,23 kuning hijau 0,41 hijau. Pada pengamatan dengan sinar
visible tampak, noda akan berwarna kuning pada UV 254 nm dan 5 noda dengan Rf 0.10, 0.13 dan 0,20 biru menandakan adanya senyawa flavonoid, Rf 0,23
hijau muda menandakan adanya senyawa alkaloid Marliana, et al., 2005.
Universitas Sumatera Utara
a b c
Gambar 4.1 Kromatogram Sampel EEABA ekstrak etil asetat buah andaliman
dengan fase gerak etilasetat:n-heksan 8:2 Ket: a EEABAtanpa pereaksi pada visible tampak 400-800nm
b EEABAdengan Dragendorfpada UV 254 nm c EEABA dengan Dragendorfpada UV 366 nm
4.3 Hasil Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak
