24 4. Pori-pori gel.
Pori-pori yang lebih besar akan mempermudah pergerakan protein melewati gel.
5. Voltase. Voltase tinggi akan menyebabkan cepatnya pergerakan molekul. Hal
tersebut dikarenakan oleh tingginya muatan positif yang ditimbulkan. 6. Larutan buffer.
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga migrasi molekul akan lebih cepat.
2.6.1 Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS-
PAGE
SDS-PAGE merupakan suatu teknik elektroforesis yang menggunakan polyacrylamide sebagai bahan pemisah. SDS-PAGE banyak digunakan dalam
praktikum biologi molekuler, genetik, biokimia, dan biomedik. SDS-PAGE biasanya digunakan untuk memisahkan protein berdasarkan sifat electrophoretic
mobility pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasi dan berat molekulnya BM dalam sebuah medan listrik. Protein
yang dipisahkan dengan SDS-PAGE dapat dikarakterisasi berdasarkan berat molekulnya dengan satuan Kilo Dalton KDa. Satu dalton sama dengan satu
hidrogen molekul Bachrudin, 1999. Penggunaan SDS
‐PAGE bertujuan untuk memberikan muatan negatif pada protein yang akan dianalisa. Protein yang terdenaturasi sempurna akan mengikat
SDS dalam jumlah yang setara dengan berat molekul protein tersebut Dunn et al,1989. Denaturasi protein dilakukan dengan merebus sampel dalam buffer yang
25 mengandung β‐merkaptoetanol berfungsi untuk mereduksi ikatan disulfide,
gliserol dan SDS Walker, 1988. Muatan asli protein akan digantikan oleh muatan negatif dari anion yang terikat sehingga kompleks protein
‐SDS memiliki rasio muatan per berat molekul yang konstan Hames, 1989.
Prinsip penggunaan metode ini adalah migrasi komponen akrilamida dengan N.N` bisakrilamida. Kisi
–kisi tersebut berfungsi sebagai saringan molekul sehingga konsentrasi atau rasio akrilamid dengan bisakrilamid dapat diatur untuk
mengoptimalkan kondisi migrasi komponen protein. Metode ini sering digunakan untuk menentukan berat molekul suatu protein disamping untuk memonitor
pemurnian protein Walker, 1988. Tabel 4 di bawah memberikan komposisi yang disarankan dari gradien linier, yang berkaitan dengan berbagai konsentrasi
akrilamida pada rentang molekul protein yang tepat.
Tabel 4. Rekomendasi konsentrasi gel
Sumber: Thermo Scientific 2014
Sampel ‐sampel ekstrak protein yang diinjeksikan ke dalam sumur gel
Gambar 6 diberi warna dengan bromphenol biru yang dapat terionisasi. Fungsi pewarna adalah untuk membantu memonitor jalannya elektroforesis. Berat
molekul protein dapat diketahui dengan membandingkan Rf protein dengan protein standar yang berat molekulnya telah diketahui Walker, 1988.
Kisaran BM protein kDa Rekomendasi gel
~5-50 18
~10-80 14
~20-150 12
~30-200 10
~40-250 8
~60-300 6
~100-400 4
26
Gambar 6. Alat elektroforesis SDS-PAGE http:lh3.ggpht.com
2.6.2 Analisis Densitometri
