Saran Induksi Kalus Dan Regenerasi Tiga Genotipe Tomat (Solanum Lycopersicum L) Melalui Kultur Antera

4.1 Pendahuluan

Penggunaan kultur antera dalam program pemuliaan tomat saat ini belum mendapat perhatian karena terbatasnya informasi mengenai daya kultur antera tomat di Indonesia. Berbagai hasil penelitian kultur antera tomat yang dilaporkan dari tahun 1972 Sharp et al. 1972 hingga 2010 Motallebi-Azar masih terkait respon genotipe terhadap kondisi kultur dan kajian mengenai faktor-faktor pembatas keberhasilannya. Belum ada metode yang baku hingga saat ini disebabkan karena besarnya pengaruh genotipe yang digunakan. Keberhasilan kultur antera tomat juga dipengaruhi oleh komposisi media kultur, fase perkembangan mikrospora Seguì-Simarro dan Nuez 2005, kondisi fisiologi tanaman donor, pra perlakuan sebelum kultur Motallebi-Azar dan Panahandeh 2010, dan kondisi lingkungan kultur. Media kultur merupakan faktor yang sangat mempengaruhi keberhasilan kultur antera tomat. Komponen penyusun media kultur adalah garam-garam anorganik, zat pengatur tumbuh, vitamin, asam amino, sumber karbon, osmotika, dan air Gamborg dan Phillips 1995. Komposisi media dan pH selain menentukan keberhasilan tanaman juga menentukan arah perkembangan eksplan pada awal perkembangannya. Kebutuhan nutrisi antara jaringan yang berasal dari bagian yang berbeda akan berbeda kebutuhan nutrisinya. Oleh karena itu, tidak ada satu pun media dasar yang berlaku universal untuk semua jenis jaringan dan organ. Media yang paling luas penggunaannya adalah media MS Murashige dan Skoog 1962 Zulkarnain 2009. Selain media MS, media lain yang juga digunakan dalam kultur antera adalah media B5 pada kultur antera padi Dewi et al. 2004, media Dumas De Vaulx et al. 1981 pada kultur cabai Irikova et al. 2011 dan modifikasi media MMS yang merupakan media modifikasi MS pada kultur antera anturium Rachmawati 2005. Media kultur antera tomat meliputi media induksi kalus dan regenerasi tanaman. Media induksi kalus maupun regenerasi pada kultur antera tomat belum baku sehingga belum ada media yang dapat digunakan secara universal. Media yang telah berhasil menginduksi kalus dan regenerasi tunas bervariasi sesuai dengan genotipe yang digunakan. Media dasar yang digunakan adalah MS Murashige dan Skoog 1962 dan MS1 Gamborg dan Eveleigh 1968; Gresshoff dan Doy 1972 dan MS2 Gresshoff dan Doy 1972; Blaydes 1996;. Media MS1 dan MS2 digunakan oleh Gresshoff dan Doy 1972 dalam penelitian kultur antera tomat dan menemukan bahwa media MS1 dengan tambahan ZPT kinetin dan NAA yang kemudian diberi nama DBM1 menginduksi kalus secara optimal. Media ini juga berhasil menginduksi kalus pada penelitian Summers et al. 1992 dan Motallebi-Azar 2010a. Selain media DBM1, terdapat juga media DBM2 dan DBM3 yang merupakan media buatan Gresshoff dan Doy dengan tambahan zat pengatur tumbuh Kinetin dan NAA. Media DBM memiliki beberapa perbedaan konsentrasi dan komposisi dengan media MS Murashige dan Skoog 1962. Media MS Murashige dan Skoog 1962 juga digunakan oleh Motallebi-Azar 2010a dan berhasil menginduksi kalus dan meregenerasikan tanaman. Kombinasi ZPT yang digunakan pada media MS untuk kultur antera tomat antara lain Zeatin dan IAA, 2.4 D dan Kinetin, serta 2ip dan IAA. Penggunaan genotipe yang responsif akan meningkatkan efisiensi produksi kalus dan tanaman masing-masing 85 dan 46 Motallebi-Azar 2010a, sedangkan seleksi media yang tepat dapat meningkatkan efisiensi pembentukan kalus dan tanaman masing-masing 13 dan 18 Jaramilllo dan Summers 1990. Antera yang dikulturkan pada media akan menyerap zat-zat dari dalam media sehingga akan menghentikan lintasan gametofitik pada mikrospora dan memaksanya ke arah lintasan sporofitik agar menghasilkan sel-sel kalus Dewi dan Purwoko 2011. Keberhasilan induksi kalus dan regenerasi tanaman selain dipengaruhi oleh media juga dipengaruhi oleh fase perkembangan mikrospora Shtereva et al. 1998. Hal ini karena pembentukan kalus atau embrio pada tahap awal kultur antera sangat bergantung pada fase perkembangan mikrospora. Upaya yang dapat dilakukan dalam penelitian ini adalah menggunakan media kultur antera tomat yang telah berhasil menginduksi kalus dan meregenerasikan tanaman, serta menggunakan fase perkembangan mikrospora yang diketahui dari berbagai hasil penelitian dapat menginduksi kalus dan meregenerasikan tunas. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui tanggap androgenesis genotipe Tora, Ratna dan Permata dan memperoleh media induksi kalus dan regenerasi yang paling baik untuk kultur antera tomat yang digunakan.

4.2 Bahan dan Metode

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biologi Sel dan Jaringan, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetika Pertanian BB Biogen, dan Rumah Kaca Cikeumeh, Cimanggu, Bogor pada bulan Juni 2015 hingga April 2016. Bahan tanaman yang digunakan terdiri atas tiga genotipe yaitu, Tora, Ratna dan hibrida Permata. Tora dan Ratna diperoleh dari koleksi Laboratorium Pemuliaan Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura, IPB. Hibrida Permata, milik PT Panah Merah diperoleh dari toko pertanian Tani Jaya, Dramaga. Media tanam yang digunakan terdiri atas 6 media induksi kalus M1, M2, M3, M4, M5, M6 dan 2 media induksi tunas R1 dan R2. Semua kalus yang diperoleh terlebih dahulu dipindahkan ke media proliferasi kalus, tanpa memperhatikan asal media. Kalus yang telah berproliferasi selanjutnya dipindahkan pada media regenerasi. Media induksi kalus M1, M2, dan M3 berasal dari penelitian Gresshoff dan Doy 1972. Media M4 dan M5 berasal dari penelitian Motallebi-Azar 2010a dan media M6 berasal dari penelitian Zagorska et al. 2005. Komposisi ke enam media tersebut adalah sebagai berikut: M1 DBMI + 5 mg L -1 kinetin + 2 mg L -1 NAA, M2 DBMII + 1 mg L -1 kinetin + 2 mg L -1 NAA, M3 DBMIII + 0.01 mg L -1 kinetin + 5 mg L -1 NAA, M4 MS + 1 mg L -1 2ip + 2 mg L -1 IAA, M5 MS + 0.02 mg L -1 2.4-D + 2 mg L -1 kinetin, dan M6 MS + 0.25 mg L -1 Zeatin + 0.5 mg L -1 IAA. Media induksi tunas R1 MS + 1 mg L -1 Zeatin + 0.125 mg L -1 IAA berasal dari penelitian Motallebi-Azar 2010a, dan media R2 MS + 0.25 mg L -1 Zeatin berasal dari penelitian Seguì-Simarro dan Nuez 2005.

4.2.1 Induksi Pembentukan Kalus pada Enam Media Kultur

Percobaan dirancang menggunakan Rancangan Acak Lengkap dua faktor. Faktor pertama yaitu genotipe yang terdiri dari 3 genotipe Tora, Ratna, dan Permata. Faktor kedua yaitu media yang terdiri atas 6 media M1, M2, M3, M4, M5, dan M6, sehingga terdapat 18 kombinasi perlakuan. Tiap kombinasi perlakuan diulang sebanyak 5 kali, sehingga terdapat 90 satuan percobaan. Satu satuan percobaan adalah satu petri yang berisi 20 antera. Kuncup yang digunakan untuk semua genotipe pada percobaan dua berukuran 3 hingga 7 mm yang mengandung antera pada fase meiosis, tetrad hingga mikrospora. Hal ini didasarkan pada penelitian sebelumnya bahwa induksi kalus pada kultur antera tomat dapat dihasilkan pada semua fase mikrospora, yaitu fase meiosis Zagorska et al. 1998; Summer et al. 1992; Gresshoff dan Doy 1972, tetrad Zamir et al. 1980, uninukleat Gulshan et al. 1981 hingga mikrospora Sharp et al. 1972. Hasil percobaan 1 digunakan sebagai indikator untuk mengetahui letak ke tiga fase tersebut berdasarkan panjang kuncup. Kuncup diambil pada pagi hari selama 25 hingga 30 hari masa berbunga Motallebi-Azar 2010. Kuncup yang telah diambil, selanjutnya disimpan pada suhu 5 C selama 48 jam. Kuncup yang telah diberi pra perlakuan selanjutnya disterilisasi di dalam Laminar Air Flow Cabinet. Kuncup direndam dalam larutan Clorox 20 selama 10 menit, kemudian dibilas dengan air steril sebanyak 3 kali dan ditiriskan pada kertas saring steril. Antera kemudian dipisahkan dari kuncup bunga menggunakan pinset lalu diinokulasi pada petri yang berisi 25 ml media induksi kalus. Tiap petri berisi 20 antera yang berasal dari 4 kuncup bunga. Petri yang telah berisi antera diinkubasi gelap selama 6 minggu pada suhu 26 ± 2 C kemudian dipindahkan pada kondisi penyinaran 168 jam dengan suhu yang sama Motallebi-Azar 2010a. Pengamatan dilakukan terhadap lamanya inisiasi kalus dalam hari setelah tanam HST, jumlah kalus yang terbentuk dan jumlah antera berespon per kuncup. Data primer yang diperoleh digunakan untuk menghitung persentase kalus terhadap jumlah antera. Antera berespon dihitung dengan membuat modus data jumlah antera yang menghasilkan kalus yang diperoleh dari lima kuncup pada tiap genotipe. Data dianalisis menggunakan analisis ragam dan akan dilanjutkan dengan uji DMRT pada taraf α= 5 bila terdapat pengaruh pada perlakuan. Persentase kalus terhadap jumlah antera = Jumlah kalus Jumlah total antera x 100

4.2.2 Induksi Pembentukan Tunas pada Dua Media Regenerasi

Penelitian dirancang menggunakan Rancangan Acak Lengkap dua faktor. Faktor pertama adalah kalus dari 3 genotipe Tora, Ratna dan Permata yang berasal dari percobaan 1. Faktor kedua adalah media induksi tunas yang terdiri atas 2 media R1 dan R2, sehingga terdapat 6 kombinasi perlakuan. Tiap kombinasi perlakuan diulang sebanyak 8 kali sehingga terdapat 48 satuan percobaan. Satu satuan percobaan adalah satu botol yang berisi 3 kalus. Kalus dari tiap genotipe yang telah berukuran sekitar 2 mm dipindahkan pada media proliferasi kalus yaitu MS + 2.5 mg L -1 NAA + 3 BAP mg L -1 . Kalus yang telah memiliki ukuran sekitar 5 hingga 10 mm dipindahkan pada media regenerasi. Kalus yang sudah dipindahkan ke media regenerasi, selanjutnya diinkubasi pada suhu 26 ± 2 C dengan penyinaran 168 jam. Pengamatan dilakukan terhadap diameter kalus pada minggu ke empat dan ke enam, lamanya inisiasi tunas dalam hari setelah tanam HST dan jumlah tunas. Data primer jumlah tunas digunakan untuk menghitung persentase jumlah tunas terhadap jumlah kalus dan data primer diameter kalus digunakan untuk menghitung pertambahan diameter kalus. Efisiensi pembentukan tunas dari setiap genotipe yang dikulturkan pada dua media induksi tunas dinyatakan dengan persentase jumlah tunas terhadap jumlah kalus. Data