Tabel 4 Urutan basa nukleotida primer Operon Technology
No. Primer Urutan
Basa
1 OPO-10
5 TCAGAGCGCC 3 2 OPO-14
5 AGCATGGCTC
3 3 OPY-13
5 CACAGCGACA
3 4 OPY-20
5 AGCCGTGGAA3
Secara umum, proses PCR melalui 3 tahapan penting yaitu denaturation, annealing,
dan extension. Dalam proses PCR dibutuhkan suhu yang berbeda-beda tergantung pada teknik, bahan kimia, dan juga primer yang digunakan. Adapun
tahapan dalam proses PCR dengan menggunakan teknik RAPD dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5 Tahapan proses PCR-RAPD
Tahapan Suhu Waktu
Jumlah Siklus
Pra-denaturation 95
o
C 2 menit
1 Denaturation
Annealing Extension
95
o
C 37
o
C 72
o
C 1 menit
2 menit 2 menit
45 45
45 Final Extension
72
o
C 5 menit
1
3.3.3 Uji Kualitas dan Kuantitas DNA
Untuk menguji kualitas DNA hasil ekstraksi dilakukan elektroforesis dengan menggunakan gel agarose dengan konsentrasi sebesar 1 bv, dimana
15 ml buffer TAE 1x dicampurkan dengan 0.15 gram agarose untuk cetakan kecil 8-12 sumur, dan 33 ml buffer TAE dicampurkan dengan 0.33 gram agarose
untuk cetakan besar 17-25 sumur. Campuran agar 1 tersebut dipanaskan di dalam microwave untuk selanjutnya dituangkan ke dalam cetakan dan ditunggu
sampai padat, kemudian disimpan di dalam bak elektroforesis yang berisi buffer TAE.
Setelah agar yang padat berada di dalam bak elektroforesis, 3 µl Blue Juice
10x dan 4 mikro liter DNA dicampurkan dan dimasukkan ke dalam lubang- lubang di dalam agarose dengan menggunakan mikropipet. Elektroforesis
dilakukan dengan menggunakan aliran listrik dengan tegangan 100 volt sekitar 30 menit. Pada prinsipnya, proses elektroforesis dilakukan dengan memigrasikan
DNA dalam gel agarose dari arus - ke arus +. Untuk melihat hasil elektroforesis dilakukan pewarnaan dengan larutan Ethidium Bromida EtBr
dengan konsentrasi 1 vv, dan selanjutnya pita DNA hasil isolasi dilihat dengan menggunakan alat UV transilluminator.
Untuk menguji kualitas DNA hasil PCR, dilakukan elektroforesis dengan menggunakan gel agarose dengan konsentrasi sebesar 2 bv, dimana 15 ml
buffer TAE 1x dicampurkan dengan 0.30 gram agarose untuk cetakan kecil 8-12
sumur, dan 33 ml buffer TAE dicampurkan dengan 0.66 gram agarose untuk cetakan besar 17-25 sumur. Campuran agar 2 tersebut dipanaskan di dalam
microwave untuk selanjutnya dituangkan ke dalam cetakan dan ditunggu sampai
padat, kemudian disimpan di dalam bak elektroforesis yang berisi buffer TAE. Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan aliran listrik dengan
tegangan 80 volt sekitar 45-60 menit. Pada prinsipnya, proses elektroforesis dilakukan dengan memigrasikan DNA dalam gel agarose dari arus - ke arus +.
Untuk melihat hasil elektroforesis dilakukan pewarnaan dengan larutan Ethidium Bromida
EtBr dengan konsentrasi 1 vv. Selanjutnya pita DNA hasil isolasi dilihat dengan menggunakan alat UV transilluminator lalu difoto untuk kemudian
diinterpretasi dan dianalisis.
3.4 Analisis Data 3.4.1 Skoring Hasil Amplifikasi DNA dengan Teknik PCR-RAPD
