3.3.1 Ekstraksi DNA
Ektraksi DNA merupakan metode pemisahan DNA dari bahan-bahan yang tidak diperlukan. Untuk mengurangi aktivitas enzim selama ekstraksi digunakan
nitrogen cair, yang juga dapat mempermudah proses penghancuran bahan
tanaman. Metode yang digunakan untuk ekstraksi adalah metode CTAB Cetyl
Trimethyl Ammonium Bromide , dari Murray Thompson 1980 yang telah
dimodifikasi Brown 1991 sebagaimana yang diacu dalam Yunanto 2006. Bahan yang akan dianalisis berupa contoh uji kayu Jati, dibor dalam
keadaan steril menggunakan ukuran mata bor 2.5 mm. Pengambilan serbuk dilakukan pada bagian kayu gubal sebanyak 0.2 g dan dimasukan dalam tube.
Serbuk tersebut kemudian ditambahkan 500-700 µL larutan buffer ekstrak Tris- HCl 1M pH 8.0, NaCl 5M, EDTA 0.5M, CTAB 10, merkaptoetanol, PVP 1
dan H
2
O serta 100 µL PVP 2 kemudian divortex. Setelah itu dilakukan inkubasi di dalam mangkok porselin berisi air yang dipanaskan di atas kompor
listrik selama 45 menit pada suhu 65
o
C. Stirer berukuran 5 mm dimasukan dalam tube
untuk mengoptimalkan ekstraksi selama proses inkubasi. Selama proses inkubasi, air dalam mangkuk porselin harus tetap dikontrol.
Untuk memisahkan antara cairan pelarut dengan cairan yang mengandung DNA supernatant ditambahkan chloroform IAA 500
μl dan fenol 10 μl, kemudian dikocok dan disentrifugasi pada kecepatan 13 000 rpm selama 2 menit.
Hasil sentrifugasi terpisah menjadi dua fase yaitu bagian atas merupakan fase air yang berisi asam nukleat supernatant dan bagian bawah yaitu fase organik yang
berisi pelarut organik. Cairan yang mengandung DNA supernatant dipindahkan ke dalam tube baru. Proses tersebut dilakukan sebanyak dua kali.
Untuk mendapatkan pellet DNA, supernatant ditambahkan isopropanol dingin 500 mikro liter dan NaCl 300 mikro liter dan disimpan di dalam freezer
selama 45 menit-1 jam. Pemberian isopropanol dingin dan garam NaCl menyebabkan pengendapan DNA dan terbentuknya benang-benang asam nukleat
yang halus dan berwarna putih. Fase padat pellet dicuci dengan etanol 100
sebanyak 300 mikro liter yang ditambahkan ke dalam tube untuk memurnikan DNA dari sisa-sisa bahan kimia. Proses tersebut dilakukan 2 kali, kemudian
dikeringkan di dalam desikator ±15 menit. Langkah terakhir adalah menambahkan
buffer TE sebanyak 20
μl. Hal ini dilakukan agar DNA lebih stabil. DNA akan lebih stabil dalam keadaan larutan dibandingkan dalam bentuk benang-benang
halus. Buffer TE yang mengandung tris-HCL dan EDTA mampu mengkelat logam yang dapat menjadi kofaktor enzim nuklease Sambrook et al. 1989, diacu dalam
Nuryani 2003.
3.3.2 Proses Amplifikasi DNA dengan Teknik PCR-RAPD Polymerase Chain Reaction-Random Ampified Polymorphic DNA
DNA hasil proses ekstraksi sebelum dilakukan proses amplifikasi harus dilakukan pengenceran dengan menggunakan aquabidest. Besarnya perbandingan
antara DNA dengan aquabidest tergantung dari tebal dan tipisnya DNA genomik hasil ekstraksi.
Proses amplifikasi dengan metode RAPD menggunakan bahan kimia dari Promega. Secara umum proses amplifikasi DNA dengan metode PCR-RAPD
menggunakan 4 komponen utama yang dicampurkan ke dalam microtube ukuran 0.2 ml. Komponen yang diperlukan untuk teknik RAPD disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3 Komposisi bahan untuk reaksi PCR pada teknik RAPD
No. Nama Bahan
1 Contoh Uji Reaksi X Sample Reaksi
1 H
2
O 2.5 μl
X x 2.5 μl
2 Go Taq Green Master Mix Qit
7.5 μl
X x 7.5 μl
3 Primer 1.5
μl X x 1.5
μl 4
Cetakan DNA 2
μl X x 2
μl
Primer yang digunakan adalah primer yang telah digunakan pada penelitian Kholik 2008, yaitu primer dari golongan OPO dan OPY. Primer dari
golongan OPO yang digunakan untuk proses amplifikasi DNA adalah yang memiliki kode O10 dan O14. Sedangkan primer dari golongan OPY yang
digunakan adalah yang memiliki kode Y13 dan Y20. Urutan basa nukleotida primer golongan OPO dan OPY Yunanto 2006 disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4 Urutan basa nukleotida primer Operon Technology
No. Primer Urutan
Basa
1 OPO-10
5 TCAGAGCGCC 3 2 OPO-14
5 AGCATGGCTC
3 3 OPY-13
5 CACAGCGACA
3 4 OPY-20
5 AGCCGTGGAA3
Secara umum, proses PCR melalui 3 tahapan penting yaitu denaturation, annealing,
dan extension. Dalam proses PCR dibutuhkan suhu yang berbeda-beda tergantung pada teknik, bahan kimia, dan juga primer yang digunakan. Adapun
tahapan dalam proses PCR dengan menggunakan teknik RAPD dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5 Tahapan proses PCR-RAPD
Tahapan Suhu Waktu
Jumlah Siklus
Pra-denaturation 95
o
C 2 menit
1 Denaturation
Annealing Extension
95
o
C 37
o
C 72
o
C 1 menit
2 menit 2 menit
45 45
45 Final Extension
72
o
C 5 menit
1
3.3.3 Uji Kualitas dan Kuantitas DNA
Kategori