Optimasi Kondisi Analisis HASIL DAN PEMBAHASAN

36 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

4.4 Penetapan Metode Ekstraksi

Sebelum dianalisis menggunakan KCKT, N-hidroksietil-p-metoksi sinamamida dalam plasma perlu diekstraksi terlebih dahulu, terutama protein yang ada dalam plasma. Ekstraksi N-hidroksietil-p-metoksi sinamamida dalam plasma dilakukan dengan menggunakan pelarut organik, yaitu metanol. Penyiapan sampel dengan menggunakan metanol sebagai pengendap protein ini bertujuan untuk memisahkan analit dari gangguan yang ada dalam plasma seperti protein dan senyawa endogen lainnya. Penambahan larutan organik seperti metanol pada larutan protein dalam air akan menurunkan konstanta dielektrik air yang meningkatkan tarikan antara molekul-molekul bermuatan dan memfasilitasi interaksi elektrostatik protein. Selain itu pelarut organik juga akan menggantikan beberapa molekul air disekitar daerah hidrofob dari permukaan protein yang berasosiasi dengan protein sehingga menurunkan konsentrasi air dalam larutan dengan demikian kelarutan protein akan menurun dan memungkinkan terjadinya pengendapan. Pada penelitian ini, ekstraksi dilakukan dengan menambahkan sejumlah metanol ke dalam plasma. Komposisi yang diujikan adalah metanol-plasma dengan perbandingan 1 : 1 dan 4 : 1, kemudian dilakukan perngamatan kromatogram plasma blangko dengan melihat apakah pada daerah waktu retensi N-hidroksietil-p-metoksi sinamamida terdapat pengotor plasma atau tidak. Hasil yang diperoleh dari kedua komposisi metanol yang diujikan untuk mengendapkan protein adalah tidak satupun komposisi pelarut yang menghasilkan puncak pengotor pada waktu retensi N- hidroksietil-p-metoksi sinamamida saat analisis dilakukan. Gambar dapat dilihat pada Gambar 4.5 dan 4.7. Kemudian dilakukan ekstraksi dengan proses yang sama pada plasma yang telah mengandung N-hidroksietil-p-metoksi sinamamida. Selanjutnya dilakukan pengamatan kromatogram plasma yang mengandung N-hidroksietil-p-metoksi sinamamida dengan membandingkan luas area, jumlah lempeng teoritis, resolusi, dan asimetrisitas puncak N-hidroksietil-p-metoksi sinamamida pada masing-masing perbandingan metanol untuk mengendapkan protein. Gambar dapat dilihat pada gambar 4.6 dan gambar 4.8. Berikut data hasil analisis N-hidroksietil-p-metoksi sinamamida yang diekstraksi dengan beberapa perbandingan metanol dapat dilihat pada tabel 4.3. 37 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 4.3 Hasil optimasi pengendapan protein Pengendap Protein Luas Area mAU Lempeng Teoritis Resolusi Asimetrisitas 1x Metanol 3,857 46 0,72 1,13 4x Metanol 1,914 194 3,37 1,19 Gambar 4.5 Kromatogram plasma blangko dengan perbandingan metanol - plasma 1:1 dengan fase gerak metanol-air 40:60vv, kecepatan alir 1,0 mLmenit, panjang gelombang 290 nm dan volume penyuntikan 20,0 µL Gambar 4.7 Kromatogram plasma blangko dengan perbandingan metanol - plasma 4:1 dengan fase gerak metanol-air 40:60vv, kecepatan alir 1,0 mLmenit, panjang gelombang 290 nm dan volume penyuntikan 20,0 µL Keterangan: A. Pengotor plasma, B. N-HEPMS Gambar 4.6 Kromatogram N-hidroksietil- p-metoksi sinamamida dalam plasma dengan perbandingan metanol - plasma 1:1 dengan fase gerak metanol-air 40:60vv, kecepatan alir 1,0 mLmenit, panjang gelombang 290 nm dan volume penyuntikan 20,0 µL Keterangan: A. Pengotor plasma, B. N-HEPMS Gambar 4.8 Kromatogram N-hidroksietil- p-metoksi sinamamida dalam plasma dengan perbandingan metanol - plasma 4:1 dengan fase gerak metanol-air 40:60vv, kecepatan alir 1,0 mLmenit, panjang gelombang 290 nm dan volume penyuntikan 20,0 µL A B A B 38 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Dari data diatas, dengan membandingkan kedua komposisi metanol yang digunakan untuk mengendapkan protein plasma dapat dilihat bahwa pada penambahan metanol 4 kali volume plasma memberikan pemisahan yang paling baik dengan pengotor dalam plasma, yaitu dengan nilai resolusi 3,37 dimana telah memenuhi persyaratan resolusi ≥1,5, serta menghasilkan puncak senyawa dengan kriteria puncak yang paling baik. Hal ini dapat dilihat dari nilai resolusi yang lebih besar, nilai lempeng teoritis yang lebih besar, serta asimetrisitas yang kecil bila dibandingkan dengan penambahan metanol 1 kali volume plasma. Nilai resolusi yang besar menyatakan metode ekstraksi menggunakan metanol 4 kali volume plasma dapat memisahkan puncak pengotor plasma yang muncul pada waktu retensi sekitar 1,753 dengan puncak N-hidroksietil-p-metoksi sinamamida yang muncul pada waktu retensi sekitar 7,237 dengan pemisahan yang paling baik.

4.5 Validasi Metode Analisis N-hidroksietil-p-metoksi sinamamida dalam Plasma

secara In Vitro 4.5.1 Pengukuran Batas Kuantifikasi Terendah LLOQ Pengukuran sebanyak 5 konsentrasi larutan N-hidroksietil-p-metoksi sinamamida dalam plasma dengan konsentrasi 10,08 µgmL; 15,12 µgmL; 20,16 µgmL; 30,24 µgmL; dan 40,32 µgmL menghasilkan persamaan regresi y = 0,361x - 1,7941 dengan linieritas koefisien korelasi 0,9953. Dari hasil pengolahan data diperoleh LOQ 9,675 µgmL. Kemudian LLOQ dibuat dengan cara mengencerkan ½ konsentrasi LOQ. LLOQ merupakan standar terendah pada kurva kalibrasi yang dapat diterima Food and Drug Administration, 2001. Pada penelitian ini, konsentrasi LLOQ yang dibuat adalah 5,04 µgmL. 4.5.2 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linieritas dalam Plasma secara In Vitro Kurva kalibrasi merupakan hubungan antrara respon instrumen dan konsentrasi analit yang diketahui. Untuk analisis N-hidroksietil-p-metoksi sinamamida dalam plasma, kurva kalibrasi terdiri dari plasma blangko plasma tanpa penambahan N-hidroksietil-p-metoksi sinamamida dan 6 konsentrasi N-hidroksietil-p-metoksi sinamamida dalam plasma termasuk LLOQ yaitu 5,04 µgmL; 10,08 µgmL; 15,12 µgmL; 20,16 µgmL; 30,24 µgmL; dan 39 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 40,32 µgmL. Persamaan garis kurva kalibrasi yang diperoleh adalah y = 0,3559x - 1,6435 dengan koefisien korelasi 0,9962; dimana x adalah konsentrasi senyawa dan y adalah luas area senyawa. Koefisien korelasi ini mendekati persyaratan nilai koefisien korelasi yang ideal sehingga dapat dapat disimpulkan bahwa metode analisis N-hidroksietil-p-metoksi sinamamida dalam plasma dengan konsentrasi 5,04 – 40,32 µgmL memenuhi kriteria uji linieritas dan dapat diterima untuk suatu metode analisis yang valid. Pada analisis senyawa dalam plasma, nilai koefisien korelasi yang dapat diterima adalah lebih dari 0,95 Food and Drug Administration, 1998. Kurva kalibrasi dalam plasma dapat dilihat pada gambar 4.9. Kemudian dari pengolahan data kurva kalibrasi tersebut diperoleh nilai LOD 2,982 µgmL dan LOQ 9,037 µgmL. Gambar 4.9 Kurva Kalibrasi N-hidroksietil-p-metoksi sinamamida dalam plasma 4.5.3 Uji Selektivitas Selektivitas adalah kemampuan metode analisis untuk membedakan dan mengukur secara kuantitatif analit dengan adanya komponen lain di dalam sampel Food and Drug Administration, 2001. Pada percobaan ini komponen lain tersebut adalah pengotor plasma. Uji selektivitas ini dilakukan terhadap enam plasma manusia dari sumber yang berbeda pada konsentrasi LLOQ yaitu 5,04 µgmL, diperoleh nilai koefisien variasi 2,123 dan diff antara 8,795 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 10 20 30 40 50 R a ta -r a ta lua s a r e a m A U Konsentrasi µgmL Kurva Kalibrasi N-hidroksietil- p- metoksi sinamamida dalam Plasma