13
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Hasil reaksi yang diperoleh disebut dengan silika fase terikat yang stabil terhadap hidrolisis karena terbentuk
ikatan-ikatan siloksan Si-O-O-Si. Silika yang dimodifikasi ini mempunyai karakteristik kromatografi dan selektifitas
yang berbeda jika dibandingkan dengan silika yang tidak dimodifikasi.
Oktadesil silika ODS atau C18 merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan
senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi Gandjar dan Rohman, 2007.
2.4.2.7 Detektor
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan,
yaitu detektor
universal yang
mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan
tidak bersifat selektif seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang
spesifik, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu
detektor harus
mempunyai karakteristik sebagai berikut:
a. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan
reprodusibel, b.
Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil,
c. Stabil dalam pengoperasiannya,
d. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu
meminimalkan peleburan
pita. Untuk
kolom konvensional, selnya bervolume 8 µl atau lebih kecil,
sementara kolom mokrobor selnya bervolume 1 µl atau lebih kecil lagi,
14
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
e. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan
konsentrasi solut pada kisaran yang luas kisaran dinamis linier, dan
f. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir
fase gerak.
Beberapa detektor yang sering digunakan pada KCKT : a.
Detektor Spektrofotometri UV-Vis Detektor ini didasarkan pada adanya penyerapan
radiasi ultraviolet UV dan sinar tampak Vis pada kisaran panjang gelombang 190-800 nm oleh spesies
solut yang mempunyai struktur-struktur atau gugus- gugus kromoforik. Detektor spektrofotometri UV-Vis
dapat berupa detektor dengan panjang gelombang tetap merupakan detektor yang paling sederhana serta
detektor dengan panjang gelombang bervariasi.
b. Detektor photodiode-array PDA
Detektor PDA merupakan detektor UV-Vis dengan berbagai keistimewaaan. Detektor ini mampu
memberikan kumpulan kromatogram secara simultan pada panjang gelombang yang berbeda pada sekali
proses single run. Selama proses berjalan, suatu kromatogram pada panjang gelombang yang diinginkan
biasanya antara 190-400 dapat ditampilkan.
c. Detektor Flouresensi
Fluoresensi merupakan fenomena luminisensi yang terjadi ketika suatu senyawa menyerap sinar UV
atau visibel lalu mengemisikannya pada panjang gelombang yang lebih besar. Tidak semua senyawa
obat mempunyai sifat flouresen sehingga detektor
15
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
flouresensi ini sangat spesifik. Disamping itu, detektor ini juga sangat sensitif dibandingkan dengan detektor
UV.
d. Detektor Indeks Bias
Detektor ini akan merespon setiap perbedaan indeks bias antara analit zat terlarut dengan
pelarutnya fase geraknya. Penggunaan detektor ini terutama
untuk senyawa-senyawa
yang tidak
mempunyai gugus kromofor.
e. Detektor Elektrokimia
Detektor ini bekerja berdasarkan oksidasi dan reduksi senyawa organik termasuk obat secara
elektrokimia pada elektroda yang cocok. Gandjar dan Rohman, 2007.
2.4.2.8 Komputer, Integrator, atau Rekorder
Alat pengumpul data seperti komputer, integrator, atau rekorder dihubungkan dengan detektor. Alat ini akan
mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh detektor lalu memplotkannya sebagai suatu kromatogram yang
selanjutnya dapat dievaluasi oleh analis Gandjar dan Rohman, 2007.
2.5 Uji Kesesuaian Sistem
Seorang analisis harus memastikan bahwa sistem dan prosedur yang digunakan mampu memberikan data yang dapat diterima. Hal ini dapat
dilakukan dengan uji kesesuaian sistem. Uji kesesuaian sistem adalah serangkaian uji untuk menjamin bahwa metode tersebut dapat
menghasilkan akurasi dan presisi yang dapat diterima. Persyaratan-
16
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
persyaratan kesesuian sistem biasanya dilakukan setelah dilakukan pengembangan metode dan validasi metode.
United States Pharmacopeia USP menentukan parameter yang dapat digunakan untuk menentukan kesesuaian sistem sebelum analisis.
Parameter-parameter yang digunakan meliputi: jumlah lempeng teoritis N, asimetrisitas, faktor kapasi
tas k’ atau α dan nilai standar deviasi relatif RSD tinggi puncak dan luas puncak dari serangkaian injeksi. Pada
umumnya, paling tidak ada 2 kriteria yang biasanya dipersyaratkan untuk menunjukkan kesesuaian sistem suatu metode. Parameter yang berguna
untuk uji kesesuaian sistem adalah keberulangan penyuntikan larutan baku yang dinyatakan dalam standar deviasi relatif RSD yang dinyatakan
dalam persen bila tidak dinyatakan lain dalam monografi baku yang digunakan dengan nilai RSD kurang dari 2 Farmakope Indonesia edisi
IV.
2.6 Validasi Metode Analisis
Validasi metode menurut United States Pharmacopeia USP dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik,
reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi
bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi
masalah analisis. Oleh karena itu suatu metode harus divalidasi ketika:
a. Metode baru dikembangkan untuk mengatasi masalah analisis
tertentu, b.
Metode yang
sudah baku
direvisi untuk
menyesuaikan perkembangan atau karena munculnya suatu masalah yang
mengarahkan bahwa metode baku tersebut harus direvisi, c.
Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah berubah seiring dengan berjalannya waktu,
d. Metode baku digunakan di laboratorium yang berbeda, dikerjakan
oleh analis yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda,
17
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
e. Untuk mendemonstrasikan kesetaraan antar 2 metode, seperti antara
metode baru dan metode baku. Gandjar dan Rohman, 2007.
Validasi metode bioanalisis ini digunakan pada studi farmakologi klinis, pengujian ketersediaan hayati bioavailabilitas dan bioekuivalensi,
serta uji farmakokinetika. Metode analisis yang selektif dan sensitif sangat penting untuk evaluasi obat dan metabolitnya analit secara
kuantitatif untuk keberhasilan studi farmakologi pre-klinis dan klinis. Validasi metode bioanalisis mencakup semua prosedur yang menunjukkan
bahwa metode yang digunakan untuk analisis analit secara kuantitatif di dalam matriks biologis, seperti darah, plasma, serum, atau urin dapat
dipercaya dan reprodusibel sesuai tujuan penggunaannya.
2.6.1 Tipe dan Tingkatan Validasi Dalam bioanalisis, validasi metode dibagi menjadi 3 kategori,
yaitu Food and Drug Administration, 2001: 2.6.1.1
Validasi Lengkap Validasi lengkap penting dilakukan saat melakukan
pengembangan dan implementasi metode bioanalisis untuk pertama kali. Validasi lengkap juga penting untuk obat-obat
baru dan dilakukan jika ada metabolit yang ditambahkan pada suatu penetapan kadar.
2.6.1.2 Validasi Parsial Validasi parsial merupakan suatu modifikasi dari
metode bionalasis yang telah divalidasi. Validasi parsial dilakukan mulai dari akurasi dan presisi pada proses inta-
assay sampai mendekati validasi lengkap. Perubahan metode bioanalisis yang termasuk kedalam kategori ini,
yaitu :
18
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
a. Metode bioanalisis yang di pindahkan antar laboratorium
atau analis, b.
Perubahan dalam metode analisis misal perubahan dalam sistem deteksi,
c. Perubahan dalam antikoagulan yang digunakan dalam
cairan biologis, d.
Perubahan matriks misal dari plasma menjadi urin, e.
Perubahan dalam prosedur proses sampel, f.
Perubahan spesies pada matriks yang sama misal dari rat plasma menjadi mouse plasma,
g. Perubahan dalam rentang konsentrasi,
h. Perubahan instrumen dan atau software yang digunakan,
i. Volume sampel yang terbatas misal pada studi pediatri,
j. Matriks yang jarang.
2.6.1.3 Validasi Silang Validasi silang merupakan perbandingan parameter
validasi ketika 2 atau lebih metode bioanalisis digunakan untuk mendapatkan data pada studi yang sama ataupun
studi yang berbeda. Salah satu contoh dari validasi silang adalah keadaan dimana metode bioanalisis yang telah
tervalidasi dianggap sebagai referensi dan metode bioanalisis hasil revisi dijadikan sebagai pembanding.
Perbandingan harus dilakukan dua arah.
2.6.2 Pengembangan Metode Bioanalisis
Pengukuran terhadap setiap analit dalam matriks biologis harus divalidasi terlebih dahulu. Berikut beberapa parameter pokok
untuk validasi metode bioanalisis, yaitu akurasi, presisi, selektivitas, sensitivitas, reprodusibilitas, dan stabilitas.
19
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Pengembangan dan penetapan metode bioanalisis meliputi : 2.6.2.1
Selektivitas Selektivitas adalah kemampuan metode analisis untuk
membedakan dan mengukur secara kuantitatif analit dengan adanya komponen lain di dalam sampel. Untuk selektivitas,
analisis sampel blangko dari matriks biologi yang sesuai seperti plasma, urin, atau matriks lainnya harus dilakukan
sedikitnya dari enam sumber yang berbeda. Tiap sampel blangko harus diuji terhadap interferensi, dan selektivitas
harus dipastikan pada kadar batas kuantifikasi terendah LLOQ. Jika suatu metode mengukur lebih dari satu analit,
maka tiap analit harus diuji untuk memastikan tidak ada interferensi Food and Drug Administration, 2001.
2.6.2.2 Kurva Kalibrasi
Kurva kalibrasi merupakan hubungan antara respon instrumen dan konsentrasi analit yang diketahui. Kurva
kalibrasi disiapkan dalam matriks biologi yang sama dengan sampel, dengan cara menambahkan sejumlah analit dengan
konsentrasi yang diketahui ke dalam matriks. Rentang konsentrasi standar dipilih berdasarkan literatur atau
penelitian. Pembuatan kurva kalibrasi harus mencakup sampel blangko matriks tanpa baku dalam, sampe zero
matriks dengan baku dalam, dan 6 sampai 8 non-zero sampel pada rentang konsentrasi standar, termasuk LLOQ.
a. Lower Limit of Quantification LLOQ
Standar terendah dari kurva kalibrasi harus diterima sebagai LLOQ jika berada pada kondisi
berikut: respon analit pada LLOQ setidaknya 5 kali respon sampel blangko, puncak analit respon harus
dapat teridentifikasi, dapat terpisah dengan baik, dan
20
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
reprodusibel dengan nilai presisi ≤20 dan akurasi
80-120.
b. Kurva Kalibrasi Kurva Standar Konsentrasi-Respon
Syarat kurva kalibrasi agar dapat diterima, yaitu nilai nilai deviasi sebesar
≤20 dari konsentrasi LLOQ dan nilai nilai deviasi sebesar
≤15 dari konsentrasi standar selain LLOQ. Sedikitnya empat
dari enam standar non-zero berada diatas kriteria diatas, termasuk LLOQ dan konsentrasi tertinggi dari
kurva kalibrasi. Food and Drug Administration, 2001
2.6.2.3 Batas Deteksi limit of detection, LOD
Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi,
meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. LOD merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan apakah analit
diatas atau dibawah nilai tertentu. Definisi batas deteksi yang paling umum digunakan dalam kimia analisis adalah
kadar analit yang memberikan respon sebesar respon blangko y
b
ditambah dengan 3 simpangan baku blangko 3S
b
. LOD dapat dihitung berdasarkan pada standar deviasi
SD respon dan kemiringan slope, S kurva baku pada level yang mendekati LOD sesuai dengan rumus, LOD =
3,3 SDS Gandjar dan Rohman, 2007.
2.6.2.4 Batas Kuantifikasi limit of quantification, LOQ
Batas Kuantifikasi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan
presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi
