UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Filter Tube dipasangkan kembali dengan Collection Tube yang baru. Kemudian 500 µl Inhibitor Removal Buffer ditambahkan
melalui penyangga atas Filter Tube dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Filter Tube
dipasangkan kembali dengan Collection Tube yang baru. Kemudian
500µl Washing
Buffer ditambahkan
dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000rpm selama 1 menit.
Pencucian dengan Washing Buffer dilakukan 2 kali. Selanjutnya, Filter Tube dilepaskan dari Collection Tube dan
cairan yang melewati filter dibuang. Filter Tube dipasangkan kembali dengan Collection Tube dan disentrifugasi kembali
selama 10 detik dengan kecepatan 12000 rpm agar semua Washing Buffer terbuang dengan sempurna.
Setelah disentrifugasi, Collection Tube dipisahkan dengan Filter Tube dan dibuang. Kemudian Filter Tube dipasangkan
dengan tabung mikrosentrifugasi steril. Ke dalam filter yang berisi DNA daging sapi, daging babi, gelatin sapi, gelatin babi,
kapsul simulasi,
dan kapsul
sampel, masing-masing
ditambahkan 150 µl Elution Buffer hangat 70
o
C. Filter Tube dan tabung mikrosentrifugasi yang telah ditambahkan Elution
Buffer disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Filter Tube dilepaskan dari tabung sentrifugasi yang
telah berisi isolat DNA. Tabung mikrosentrifugasi tersebut disimpan pada suhu 4
o
C untuk dianalisis selanjutnya. 3.4.5.
Pemeriksaan Kadar dan Kemurnian Isolat DNA Menggunakan Spektrofotometer UV Biodrop
b
, 2012 Alat dinyalakan dan panel Nucleid Acid dipilih untuk menentukan
konsentrasi dan kemurnian DNA. Sample port dibersihkan dengan tisu steril. Sebanyak 2 µl Elution Buffer dituangkan di atas sample port dan
dianalisis sebagai blanko. Sample port kembali dibersihkan menggunakan tisu steril. Identitas sampel dimasukkan pada kolom
Sample ID. Kemudian sebanyak 2 µl masing-masing DNA sampel
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dituangkan di atas sample port secara bergantian. Kemudian tombol Measure ditekan. DNA dianalisis pada panjang gelombang 260 nm
dan 280 nm. Hasil instrumentasi yang akan didapat adalah data konsentrasi DNA dengan satuan ngµl dan data kemurnian DNA
dengan perbandingan rasio A260 dan A280. 3.4.6.
Pemeriksaan Spesifisitas Primer dan Probe NCBI Uji spesifisitas primer dan probe dilakukan dengan melakukan
BLAST melalui database NCBI. Pada halaman “BLAST”, dipilih
men u “Nucleid Acid”. Kemudian pada kolom “Enter Query Sequence”
dimasukkan urutan basa primer yang akan diuji. Tombol “BLAST” diklik. Data hasil pengujian yang didapat berupa daftar spesies yang
memiliki kemiripan 99-100 dengan urutan basa primer yang diuji. 3.4.7.
Amplifikasi DNA Menggunakan Real-Time PCR Roche
b
, 2005; Roche
c
; Izzah dengan modifikasi, 2014 Larutan primer dan probe disiapkan dengan konsentrasi 10 µM dari
larutan induk dengan konsentrasi 100 µM dan disimpan dalam sebuah tube. Selanjutnya dalam tube berukuran 1,5 ml, sebanyak 15 µl PCR
Mix disiapkan dengan cara mencampurkan larutan yang terdiri atas: 1,4 µl aquabidest; 1,6 µl primer forward 10µM; 1,6 µl primer reverse
10 µM; 0,4 µl probe 10 µM; dan 10 µl LightCycler® 480 Probe Master enzim Taq DNA Polymerase, dNTP mix, dapar, dan 6.4 mM
MgCl
2
. Campuran dihomogenkan menggunakan micropipette dengan cara up and down. Kemudian, sebanyak 5 µl isolat DNA yang akan
diuji dipipet ke dalam multiwell plate pada well yang diinginkan dan ditambahkan sebanyak 15 µl PCR Mix yang telah dibuat. Multiwell
plate yang berisi campuran DNA yang akan diuji dan PCR Mix tersebut ditutup dengan sealing foil yang akan mengeliminasi
penguapan pada suhu tinggi, kemudian diletakkan pada alat Real-Time PCR. Semua proses pencampuran sampai pemipetan ke dalam
multiwall plate dilakukan pada tempat yang gelap. Tahap tersebut dilakukan untuk masing-masing DNA daging babi, daging sapi, gelatin
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
sapi, gelatin babi, kapsul simulasi, dan kapsul sampel yang akan diamplifikasi
. Program LightCycler® 480 Real-Time PCR yang akan digunakan
untuk mengamplifikasi DNA diatur dengan pengaturan seperti yang tertera dalam tabel 3.4.
Tabel 3.4. Pengaturan Program Amplifikasi pada LightCycler® 480 Real-Time PCR
Jumlah Siklus Suhu
o
C Waktu
Pre Incubation 1
95 10 menit
Amplification 65
95 10 detik
60 1 menit
72 1 detik
Cooling 1
40 10 detik
3.4.8. Analisis Data
Analisis kandungan babi dan kandungan sapi pada cangkang kapsul keras yang mengandung vitamin A dilakukan dengan melihat
hasil amplifikasi DNA pada Real-Time PCR. Jika DNA pada sampel tertentu dengan primer babi dapat teramplifikasi, maka dapat
disimpulkan bahwa gelatin pada cangkang kapsul keras tersebut berasal dari babi. Begitu juga sebaliknya, jika DNA pada sampel
tertentu dengan primer sapi dapat teramplifikasi, maka dapat disimpulkan bahwa gelatin pada cangkang kapsul keras tersebut
berasal dari sapi. Kurva amplifikasi dihasilkan dengan memplotkan jumlah siklus
secara horizontal dan nilai flouresen secara vertikal. Kurva ini dihasilkan secara otomatis oleh RT-PCR. Dari kurva tersebut,
kemudian dilihat nilai Cp Crossing Point dari setiap isolat DNA yang diuji. Adanya nilai Cp menunjukkan bahwa isolat DNA tersebut dapat
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
teramplifikasi. Cp adalah fraksi jumlah siklus dimana tingkat amplifikasi yang tercermin dari adanya flouresensi mencapai threshold
ambang. Tingkat ambang flouresensi diatur pada posisi yang sama untuk semua reaksi yang sedang diamati Vaerman et. al, 2004.
38
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Analisis Lembar Cangkang Kapsul Keras Simulasi
Cangkang kapsul simulasi dibuat dengan bahan utama gelatin, yaitu gelatin sapi dan gelatin babi secara terpisah. Gelatin yang digunakan sebanyak
30. Persentase gelatin ini sesuai dengan standar gelatin yang digunakan dalam pembuatan cangkang kapsul keras, yaitu 30 Gelatin Manufacturers
Institute of America, 2012. Sebagai plasticizer, digunakanlah bahan yang berasal dari golongan gula, yaitu sorbitol. Bahan ini digunakan untuk
membuat cangkang kapsul keras tidak terlalu kaku dan dapat diambil dari cetakan. Sorbitol yang digunakan adalah sebanyak 5. Hal ini sesuai dengan
kadar yang ditentukan dalam Handbook of Pharmaceutical Excipients 6
th
Edition untuk penggunaan sorbitol sebagai plasticizer untuk gelatin.
a b
Gambar 4.1. Lembar Cangkang Kapsul Keras Simulasi a Sapi dan b Babi
Lembaran cangkang kapsul keras simulasi yang dihasilkan berupa lapisan tipis, berwarna kuning, dan dapat digulung. Berdasarkan gambar 4.1, terlihat
bahwa lembar cangkang kapsul simulasi sapi yang dihasilkan berwarna kuning pucat dan lembar cangkang kapsul simulasi babi yang dihasilkan
berwarna kuning terang. Perbedaan warna ini disebabkan karena warna asal dari gelatin sapi berwarna kuning pucat dan gelatin babi berwarna putih
yang digunakan. Evaluasi yang dilakukan terhadap lembar cangkang kapsul keras simulasi
yang dibuat adalah mengukur kadar airnya menggunakan moisture balance analyzer. Kadar air yang didapat adalah berkisar antara 10.6-15 untuk
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
cangkang kapsul keras simulasi sapi dan untuk cangkang kapsul keras simulasi babi. Nilai ini memenuhi syarat sebuah cangkang kapsul keras, yaitu
10-15 Anonim, 1995.
4.2. Proses Identifikasi Gelatin pada Cangkang Kapsul Keras Sampel
Sebelum dilakukan proses isolasi dan amplifikasi pada cangkang kapsul dari produk yang beredar di Indonesia, terlebih dahulu dilakukan identifikasi
gelatin pada setiap cangkang kapsul sampel tersebut. Hal ini dilakukan untuk memastikan bahwa cangkang kapsul yang akan diuji berasal dari gelatin.
Pengujian sumber bahan baku dilakukan dengan cara menambahkan CuSO
4
dan NaOH ke dalam larutan sampel Anonim, 2013. Pengujian ini disebut juga uji biuret, yaitu pengujian kandungan protein pada suatu sampel.
Uji ini dapat digunakan untuk uji identifikasi gelatin, karena pada dasarnya gelatin adalah turunan protein yang diperoleh dari kolagen Shyni et. al.,
2013. Artinya, gelatin juga mengandung ikatan peptida.
Gambar 4.2. Hasil Pengujian Sumber Bahan Baku Cangkang Kapsul
1 Kontrol Positif; 2 Kontrol Negatif A. Air, B. Na Alginat, C. HPMC; dan
3Sampel A, B, C, D, E
Larutan yang diuji terdiri atas larutan gelatin sebagai kontrol positif; air, larutan koloid HPMC, dan larutan koloid natrium alginat sebagai kontrol
negatif; dan larutan cangkang kapsul sampel. HPMC dan natrium alginat digunakan sebagai kontrol negatif, karena kedua bahan tersebut dapat
digunakan sebagai bahan baku cangkang kapsul keras pula Al-Tabakha, 2010; Natalia, 2011. Pada air, larutan koloid HPMC, dan larutan koloid
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
natrium alginat tidak muncul warna violet. Sedangkan pada larutan gelatin dan kelima larutan cangkang kapsul sampel muncul warna violet. Namun karena
cangkang kapsul sampel memiliki warna yang berbeda-beda, perubahan warna violet agak sulit diamati. Berdasarkan proses identifikasi tersebut, dapat
disimpulkan bahwa kelima cangkang kapsul pada produk yang ingin diuji berasal dari gelatin.
Uji biuret hanya dapat dilakukan untuk menguji sampel yang mengandung lebih dari 2 ikatan peptida Das, 2010. Gelatin mengandung lebih dari 2
ikatan peptida, sehingga uji ini dapat dilakukan untuk mengidentifikasi gelatin. Setelah ditambahkan CuSO
4
dan NaOH, larutan gelatin, dan larutan cangkang kapsul sampel akan membentuk senyawa Cu kompleks yang
melibatkan nitrogen dari ikatan peptida dan oksigen dari air. Senyawa Cu kompleks tersebut akan membentuk warna violet pada larutan Das, 2010.
Fungsi NaOH pada proses uji tersebut adalah membuat suasana menjadi basa, sehingga gugus amida pada larutan gelatin dan larutan sampel akan bersifat
nukleofilik dan dapat berikatan dengan ion Cu.
Gambar 4.3. Reaksi yang Terjadi pada Proses Identifikasi Gelatin
Sumber: people.uwplatt.edu
4.3. Proses Isolasi DNA
Proses isolasi dibutuhkan untuk mendapatkan DNA dari setiap sampel yang ingin diamplifikasi pada RT-PCR. Prinsip isolasi terdiri atas 3 tahap,
yaitu proses penghancuran membran sel lisis, pemisahan DNA dari protein sel dengan cara pengendapan, dan purifikasi DNA Muladno, 2010.
Pada penelitian ini, isolasi dilakukan dengan menggunakan High Pure PCR Template Preparation Kit yang diproduksi oleh Roche. Metode tersebut
dipilih karena memiliki beberapa keuntungan. Pertama, meminimalisir
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
hilangnya DNA pada proses isolasi. Kedua, meminimalisir waktu jika dibandingkan dengan cara manual yang harus menyiapkan berbagai reagen
terlebih dahulu. Ketiga, mengeliminasi penggunaan senyawa organik yang berbahaya seperti fenol dan kloroform Roche
a
, 2008. Prinsip isolasi menggunakan High Pure PCR Template Preparation Kit
adalah melisiskan sel dengan bantuan chaotropic salt, kemudian mengikatkan asam nukleat sel dengan silika yang ada pada filter tube dan mengelusinya
kembali dengan low salt elution Roche
a
, 2008. Proses isolasi dimulai dengan melisiskan membran sel. Proses
penghancuran membran sel ini dilakukan oleh Tissue Lysis Buffer TLB. TLB ini mengandung Ethylenediaminetetraacetic acid EDTA yang dapat
mengikat ion magnesium yang bertugas menjaga struktur dinding sel dan juga menghambat enzim lain yang akan memotong DNA Sudjadi, 2008.
Setelah sel lisis, protein pada sel dihancurkan dengan bantuan enzim proteinase K. Enzim ini dapat memecahkan protein histon, sehingga DNA pun
terurai Muladno, 2010. Selanjutnya reagen lainnya ditambahkan secara berturut-turut, yaitu Binding Buffer BB yang dapat membuat DNA
bermuatan negatif sehingga dapat teradsorpsi oleh silika dioksida bermuatan positif yang terdapat pada filter tube; isopropanol yang berguna
untuk proses pemurnian DNA; Inhibitor Removal Buffer IRB yang berguna untuk menghilangkan berbagai pengotor yang dapat menghambat proses PCR;
Washing Buffer WB yang berguna untuk mencuci chaotropic salt dan pengotor lainnya; dan Elution Buffer EB yang berguna untuk mengelusi
DNA yang terikat pada silika Roche
d
, 2007. Masing-masing reagen ditambahkan bersamaan dengan penggantian collection tube dan disusul
dengan proses setrifugasi. Proses isolasi cangkang kapsul sampel dilakukan sama dengan proses
isolasi gelatin dan simulasi cangkang kapsul. Namun karena setelah inkubasi 21 jam terbentuk endapan putih, maka dilakukan proses sentrifugasi dengan
kecepatan 10.000 rpm selama 30 menit. Sentrifugasi dilakukan untuk memastikan larutan sampel sudah terpisah secara sempurna dengan endapan
putih tersebut. Diperkirakan endapan putih yang berasal dari cangkang kapsul
