Spektrofotometer UV untuk Pemeriksaan DNA Polymerase Chain Reaction PCR

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DNA. Enzim ini diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik, sehingga bersifat termolabil sampai suhu 95 o C. Aktivitas Taq polymerase tergantung dari jenisnya dan asal bakteri tersebut diisolasi. Handoyo dan Rudiretna, 2000 d. Nukleotida atau deoxyribonucleaside triphosphate dNTP Nukleotida merupakan bahan dasar untuk membentuk DNA baru yang bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses pemanjanan DNA Rahman et. al., 2013. Ia terdiri atas dATP, dTTP, dGTP, dan dCTP. dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer, kemudian membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA template. e. Dapar dan MgCl 2 Dapar dibutuhkan untuk menjaga pH medium tetap berada pada pH yang sesuai agar proses PCR dapat berlangsung dan menstabilkan enzim DNA polimerase. Sedangkan MgCl 2 yang menyediakan ion Mg 2+ bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi untuk menstimulasi aktivitas DNA polymerase. Dengan adanya MgCl 2 ini akan meningkatkan interaksi primer dengan DNA template yang membentuk kompleks larut dengan dNTP. Umumnya dapar PCR sudah mengandung senyawa MgCl 2 yang diperlukan. Namun, lebih disarakan agar dapat PCR dan MgCl 2 dipisahkan Handoyo dan Rudiretna, 2000. 2.7.2. Tahapan PCR Tahapan PCR melibatkan 5 tahap, yaitu 1 pradenaturasi DNA template; 2 denaturasi DNA template; 3 penempelan primer pada DNA template annealing; 4 pemanjangan primer extension, dan 5 pemantapan post-extension. Tahap 2 sampai 4 merupakan tahapan berulang siklus, dimana pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA. Tahapan PCR biasanya terdiri atas 20-35 siklus. Penggunaan jumlah siklus yang terlalu banyak dapat meningkatkan jumlah produk yang non target. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Gambar 2.8. Tahapan Proses PCR Sumber: www.flmnh.ufl.edu 1. Pemisahan atau Denaturasi Pada tahap ini, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen. Enzim Taq polymerase diaktifkan pada tahap ini Rahman et. al., 2013. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90-95 o C selama 3 menit untuk meyakinkan bahwa molekul DNA target yang ingin dilipatgandakan jumlahnya benar-benar telah terdenaturasi menjadi untai tunggal. Untuk denaturasi berikutnya, waktu yang diperlukan hanya 30 detik pada suhu 95 o C atau 15 detik pada suhu 97 o C. Suhu denaturasi dipengaruhi oleh sekuen DNA target. Jika DNA target kaya akan G-C maka diperlukan suhu yang lebih tinggi. Hal ini disebabkan karena ikatan hidrogen pada G-C lebih banyak dibandingkan ikatan A-T. Selain itu, suhu denaturasi juga tidak boleh terlalu tinggi dan waktu denaturasi yang terlalu lama, karena dapat mengakibatkan hilangnya atau berkurangnya aktivitas enzim Taq polymerase Sambrook et. al., 1989. 2. Penempelan Annealing Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50-60 o C. Dengan terjadinya penurunan suhu, primer dapat menempel pada untai UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DNA tunggal Rahman et. al., 2013. Primer akan menuju daerah yang spesifik, dimana daerah tersebut memiliki komplemen dengan primernya. Pada proses penempelan ini, ikatan hidrogen akan terbentuk. Selanjutnya enzim Taq polymerase akan berikatan, sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali. Spesifisitas PCR sangat tergantung pada suhu melting T m primer. Temperatur penempelan yang digunakan biasanya 5 o C di bawah T m Sambrook et. al., 1989. Jika suhu yang digunakan pada tahap penempelan ini tidak tepat, primer tidak akan mengikat di DNA template atau terikat di bagian yang salah. Waktu yang dibutuhkan untuk tahap ini adalah sekitar 1-2 menit Rahman, et. al., 2013. 3. Pemanjangan atau polimerasi Extention Primer yang telah menempel pada DNA template akan mengalami pemanjangan pada sisi 3 nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan template oleh DNA polimerase. Umumnya reaksi pemanjangan extension atau polimerasi, terjadi pada suhu 72-78 o C. Hal ini disebaban karena suhu tersebut merupakan suhu optimum untuk Taq polymerase. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72-78 o C diperkirakan antara 35 sampai 100 nukleotida per detik, bergantung pada dapar, pH, konsentrasi garam, dan molekul DNA target. Dengan demikian, untuk produk PCR sepanjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk tahap pemanjangan primer ini. Jumlah siklus yang dibutuhkan untuk amplifikasi tergantung pada jumlah salisan DNA template yang ada pada saat mulai reaksi dan efisiensi pemanjangan dan amplifikasi primer. Produk DNA pada siklus amplifikasi pertama akan menjadi cetakan pada siklus berikutnya. Dibutuhkan sedikitnya 25 siklus untuk memperoleh tingkat amplifikasi sekuens target yang diterima Sambrook et. al., 1989. Secara teori, hubungan kuantitatif antara jumlah awal sekuens target UIN Syarif Hidayatullah Jakarta X o dan jumlah produk PCR setiap siklus X n ketika fase eksponensial adalah X n = X o 1+E n ., dimana E adalah nilai antara 0 tidak ada amplifikasi atau 1 setiap amplikon tereplikasi setiap siklus Vaerman, et. al., 2004. 2.7.3. Real-Time PCR Real-Time PCR juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction Q-PCRqPCR atau kinetic polymerase chain reaction. Real-Time PCR adalah suatu metoda analisis yang dikembangkan dari reaksi PCR. RT-PCR adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi sekaligus mengkuantifikasi jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut, yang bersifat sensitif, spesifik, dan reprodusibel untuk asam nukleat Vaerman et. al., 2004; Arya et. al., 2005. Pada PCR konvensional, pengamatan hasil amplifikasi DNA dilakukan menggunakan elektroforesis gel agarosa pada end-point amplifikasi DNA tersebut. Sedangkan analisis menggunakan Real- Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung. Keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe penanda. Pada Real-Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforesis. Pranawaty et.al., 2012 Konsentrasi awal sekuens target ditunjukkan sebagai fraksi jumlah siklus C T atau Cycle Theshold. Nilai ini dibutuhkan untuk memperoleh adanya awal amplifikasi. Real-Time PCR tidak terpengaruh terhadap berbagai variasi komponen dalam reaksi dan kurang sensitif terhadap perbedaan efisiensi amplifikasi. Kemampuan untuk menghitung amplifikasi DNA selama fase eksponensial dihasilkan dengan mengembangkan ketelitian menghitung sekuens target. Terdapat beberapa metode untuk menegaskan spesifisitas produk amplifikasi, yaitu dengan melting temperatures, probe oligonukleotida yang dilabelkan dengan fluoresensi, metode TaqMan, hibridisasi probe. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Metode TaqMan menggunakan oligonukleotida yang menempel ke sekuens internal dalam fragmen DNA yang diamplifikasi. Biasanya oligonukleotida, yang terdiri atas 20-24 basa, dilabelkan dengan fluorescent group pada ujung 5’ dan quencher group pada akhir 3’, dimana mereka dibatasi oleh PO 2 , NH 2 , atau blocked base. Label oligonukleotida tersebut ditambahkan bersama dengan primer untuk mengamati perubahan amplifikasi sekuens target Sambrook et. al., 1989. Gambar 2.9. Kerja Fluorescent Dye dan Quencher pada Real-Time PCR Sumber : www.isu.edu Hasil peningkatan fluorescent digambarkan melalui kurva amplifikasi yang menunjukkan tiga fasa yaitu fasa awal, fasa eksponensial atau puncak dan fasa plateau atau stabil Vaerman, 2004. Gambar 2.10. Bentuk Kurva Real-Time PCR Sumber: Arya et. al., 2005 29 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB III METODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Analisis Obat dan Pangan Halal, Laboratorium Penelitian 2, dan Laboratorium Kimia Obat pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta dan Laboratorium Teknologi Gen, Balai Pengkajian Bioteknologi-BPPT Serpong, Tangerang. Waktu pelaksanaan penelitian dilakukan pada bulan Februari 2015 hingga Juni 2015. 3.2. Alat dan Bahan 3.2.1. Alat Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah spatula, plastic wrap, aluminium foil, termometer, api bunsen, mikropipet 0.5-10 µl; 2- 20 µl; 20-200 µl; dan 100-1000 µl [Bio-rad], mikropipet tip 10 µl; 200 µl; dan 1000 µl [Bio-rad], Tabung mikrosentrifugasi [Bio-rad], High Pure Filter Tube [Roche], Collection Tube [Roche], Setrifugator [Eppendorf Centrifuge 5417 R-Ogawa Seiki], Vortex [VM-300], wadah cetakan, lemari pendingin, timbangan analitik, Waterbath [Eyela], Moisture Balance Analyzer [Wiggen], satu set alat Real-Time PCR [LightCycler® 480.0-Roche], dan Spektrofotometer UV [Bio Drop]. Alat gelas yang digunakan yaitu beaker glass, erlenmeyer, batang pengaduk, gelas ukur, pipet tetes, cawan penguap, tabung reaksi, dan kaca arloji.

3.2.2. Bahan

Bahan yang diperlukan pada penelitian ini adalah Gelatin Sapi [Sigma-Aldrich], Gelatin Babi [Sigma-Aldrich], sorbitol, pewarna tartrazine, 5 sampel kapsul yang mengandung vitamin A dengan produsen yang berbeda, satu set High Pure PCR Template Preparation UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Kit meliputi: Tissue Lysis Buffer, Proteinase K, Binding Buffer, Inhibitor Removal Buffer, Wash Buffer, dan Elution Buffer [Roche], Aquabidest [Roche], Aquadest, Isopropanol [Merck], Etanol Absolut [Merck], LC 480 TaqMan Probe Master yang terdiri atas: FastStart Taq DNA Polymerase, buffer, dNTP mix, MgCl 2 6.4 mM [Roche], dan primer-probe dengan urutan basa seperti yang tertera dalam tabel 3.1. Tabel 3.1. Urutan Basa Primer dan TaqMan Probe Sumber : Tanabe et. al.., 2007 Nama Primer Urutan Basa Babi Forward 5-ATCTTGCAAATCCTAACAGGCCTG -3 Reverse 5-CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC-3 Probe 5-FAM-CACAACAACAGCTTTCTCATCAGTTAC-BHQ1-3 Sapi Forward 5-CCCGATTCTTCGCTTTCCAT-3 Reverse 5-CTACGTCTGAGGAAATTCCTGTTG-3 Probe 5-FAM-CATCATAGCAATTGCC-BHQ1-3

3.3. Tahapan Penelitian

a. Pembuatan Cangkang Kapsul Simulasi Menggunakan Gelatin Babi dan Gelatin Sapi b. Pengumpulan Sampel c. Identifikasi Gelatin pada Cangkang Kapsul Keras Sampel d. Isolasi DNA Kontrol dan Sampel e. Pemeriksaan Kadar dan Kemurnian Isolat DNA f. Pemeriksaan Spesifisitas Primer dan Probe g. Amplifikasi DNA Menggunakan Real-Time PCR h. Analisis Hasil UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4. Prosedur Kerja

3.4.1. Pembuatan Lembar Cangkang Kapsul Simulasi Menggunakan Gelatin Sapi dan Gelatin Babi Widyaninggar et. al., 2012 Tabel 3.2. Formulasi Lembar Cangkang Kapsul Keras Bahan Jumlah Gelatin 30 Sorbitol 5 Pewarna 0.05 Aquadest Ad 100 Sebanyak 9 gram gelatin sapi ditimbang dan dibasahi dengan 9 ml air panas sambil diaduk perlahan sampai homogen. Kemudian sebanyak 1.5 gram sorbitol dan 0.0015 gram pewarna ditambahkan, lalu dicukupkan sampai 30 ml aquadest. Larutan dipanaskan dan diaduk sampai semua gelatin larut dan larutan menjadi jernih. Larutan tersebut kemudian dituang ke cetakan menjadi sebuah lapisan tipis. Campuran diletakkan di dalam desikator untuk menjaga kelembabannya. Pembuatan cangkang kapsul dari gelatin babi sama dengan perlakuan seperti diatas. 3.4.2. Pengumpulan Sampel Pengumpulan sampel dilakukan secara acak dengan mendata produk vitamin yang mengandung vitamin A yang berbentuk cangkang kapsul keras yang beredar di Indonesia berdasarkan ISO 20132014. Diperoleh sebanyak 14 produsen produk vitamin yang mengandung vitamin A yang berbentuk cangkang kapsul keras. Kemudian lima produk vitamin yang berasal dari produsen yang berbeda diambil secara acak. Pengambilan sampel ini dilakukan pada tanggal 08-20 April 2015. Masing-masing sampel diberi identitas seperti yang terlihat dalam tabel 3.3. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 3.3. Identitas Sampel yang berasal dari Produsen yang Berbeda No. Sampel Identitas 1 Produsen E A 2 Produsen I B 3 Produsen N C 4 Produsen Ei D 5 Produsen V E 3.4.3. Identifikasi Gelatin pada Cangkang Kapsul Keras Sampel Anonim, 2013 Larutan uji yang digunakan untuk uji identifikasi gelatin terdiri atas larutan gelatin sebagai kontrol positif; air, larutan koloid HPMC, dan larutan koloid natrium alginat sebagai kontrol negatif; dan larutan cangkang kapsul sampel. Larutan gelatin dan larutan cangkang kapsul sampel disiapkan dengan cara meleburkan gelatin dan cangkang kapsul tersebut pada air hangat. Larutan koloid HPMC disiapkan dengan cara melarutkan 0.1 gram serbuk HPMC dalam 10 ml aquadest panas 90 o C. Sedangkan larutan koloid natrium alginat disiapkan dengan cara melarutkan 0.1 gram serbuk natrium alginat dalam 10 ml aquadest. Proses identifikasi dilakukan dengan cara mengambil sebanyak 2 ml masing-masing larutan uji, lalu menambahkannya dengan 0.05 ml larutan CuSO 4 0.7 M dan dihomogenkan. Kemudian sebanyak 0.5 ml larutan NaOH 2 M ditambahkan kedalamnya. Jika timbul warna violet, artinya sampel mengandung gelatin. 3.4.4. Isolasi dan Purifikasi DNA Kontol dan Sampel a. Preparasi Daging Sapi dan Daging Babi Roche a , 2008; Erwanto et.al., 2012 Sebanyak 50 mg daging sapi dan daging babi segar dicincang halus dengan pisau steril. Masing-masing daging tersebut dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifugasi. Kemudian ke dalam tube tersebut ditambahkan 200 µl Tissue