UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Pfeifer, 2015. Jika rasio berkisar antara 1.8 sampai 2.0, artinya asam nukleat yang diperoleh relatif murni Greene dan Rao, 1998.
Selain menggunakan spektroskopi UV dan fluorometri, metode lain yang dapat digunakan adalah elektroforesis agarosa. Metode ini dapat memastikan
adanya berat molekul DNA. Adanya noda smear pada hasil elektroforesis menandakan bahwa sampel terdegradasi atau terkontaminasi Kulkarni dan
Pfeifer, 2015.
2.6. Spektrofotometer UV untuk Pemeriksaan DNA
Spektrofotometer UV dapat digunakan untuk menghitung kadar dan kemurnian asam nukleat. Spektrofotometer ini dapat mengukur yang sangat
kecil, yaitu sekitar 0.2-2 µl tanpa harus mengencerkan sampel terlebih dahulu. Spektrum atau panjang gelombang yang dapat digunakan berkisar dari 220-
750 nm. Alat ini tidak membutuhkan kuvet dan peralatan sampel lainnya, serta dapat dibersihkan dengan cepat. Pengukuran yang dilakukan oleh alat ini
sangat cepat, yaitu hanya beberapa detik. Namun, kontaminan dalam sampel asam nukleat dapat mempengaruhi akurasi yang dihasilkan Kennedy dan
Oswald, 2011.
Gambar 2.7. Spektrofotometer UV untuk Pemeriksaan DNA
Sumber: www.labtech.ie dan www.promarchive.com
2.7. Polymerase Chain Reaction PCR
Polymerase Chain Reaction PCR merupakan alat yang dapat melakukan amplifikasi DNA yang dipilih pada daerah tertentu genom dengan bantuan
sekurangnya sepasang sekuens nukleotidanya primer yang telah diketahui Alberts et. al., 1989. PCR merupakan teknik analisis biologi molekular baru
untuk mereplikasi DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
hidup. Teknik PCR ini membutuhkan jumlah molekul DNA yang sedikit untuk kemudian diamplifikasi beberapa kali dalam fase eksponensial. Dengan
lebih banyak DNA yang tersedia, analisis yang dilakukan menjdi lebih mudah. PCR biasanya digunakan dalam laboratorium medic dan biologi untuk tujuan
deteksi penyakit keturunan, diagnosis penyakit infeksi, identifikasi sidik jari genetic, kloning gen, paternity testing, dan komputasi DNA Rahman, et. al.,
2013. Teknik ini dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1983. PCR dapat
menganalisis sampel dengan volume 10-200 µl dalam tabung reaksi kecil volume 0.2-0.5 ml dalam thermal cycler. Di dalam thermal cycler, terjadi
reaksi pemanasan dan pendinginan kepada tabung untuk memperoleh suhu yang dibutuhkan pada setiap langkah selama reaksi.
PCR digunakan untuk mengamplifikasi untai DNA yang pendek dan bagian yang teridentifikasi, yaitu dapat berupa gen tunggal atau hanya bagian
dari gen. Berbeda dengan organism hidup, proses PCR dapat menyalin fragmen DNA yang pendek, biasanya sampai 10 kb kilo base pairs.
Beberapa metode tertentu dapat menyalin fragmen sampai ukuran 40 kb, dimana ukuran tersebut lebih kecil daripada kromosom DNA pada sel eukariot
Rahman et. al., 2013. 2.7.1.
Komponen PCR Beberapa komponen penting yang dibutuhkan dalam PCR adalah
DNA template, primer, enzim Taq Polymerase, deoxyribonucleaside triphosphate
dNTP’s, dan dapar PCR. a.
DNA template atau cDNA DNA template mengandung daerah fragmen DNA yang akan
diamplifikasi Rahman et. al., 2013. Fungsi DNA template adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang
sama. DNA template dapat berupa DNA kromosom atau fragmen DNA apapun yang mengandung fragmen DNA target yang dituju.
b. Primer
Primer dibutuhkan untuk menentukan awal dan akhir daerah batas yang akan diamplifikasi dari fragmen DNA. Primer
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
merupakan untai DNA buatan yang terdiri atas tidak lebih dari 50 nukleotida biasanya 18-25 bp yang komplementer dengan urutan
nukleotida DNA template. Ia akan menempel ke DNA template pada titik awal dan akhir, tepatnya ditempat DNA polymerase
terikat dan mulai mensintesis untai DNA baru. Selain itu, primer menyediakan gugus hidroksi OH
-
pada ujung 3’ yang diperlukan untuk proses pemanjangan DNA. Rahman et. al., 2013; Handoyo
dan Rudiretna, 2000 Perancangan primer dapat dilakukan berdasarkan rutan DNA
yang telah diketahui ataupun dari urutan protein yang dituju. Data urutan DNA atau protein bisa didapatkan dari data GenBank.
Apabila urutan DNA maupun urutan protein yang dituju belum diketahui, maka perancangan primer dapat didasarkan pada hasil
analisis homologi dari urutan DNA atau protein yang telah diketahui mempunyai kekerabatan yang dekat.
Dalam perancangan primer, kriteria yang harus dipenuhi adalah: 1 Panjang basa berkisar antara 18-30 basa. Jika terlalu
pendek dapat menyebabkan mispriming; 2 Komposisi primer tersusun atas kandungan G+C jumlah G dan C yang sama atau
lebih besar dari kandungan G+C DNA target. Hal ini disebabkan karena primer dengan G+C yang rendah diperkirakan tidak akan
mampu berkompetisi untuk menempel secara efektif pada tempat yang dituju; 3 Melting Point T
m
, temperatur dimana 50 untai ganda DNA terpisah yang dipilih akan berpengaruh dalam
pemilihan suhu annealing proses PCR. Penentuan T
m
berkaitan dengan komposis primer dan panjang primer. Perhitungan T
m
dilakukan dengan rumus [2A+T+4C+G]. Sebaiknya T
m
primer berkisar antara 50
– 65
o
C; 4 Interaksi primer-primer harus dihindari, seperti cross-homology atau self-homology.
c. Enzim Taq polymerase
Taq polymerase dibutuhkan sebagai katalisator untuk reaksi polimerisasi DNA yang diperlukan untuk tahap pemanjangan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DNA. Enzim ini diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik, sehingga bersifat termolabil sampai suhu 95
o
C. Aktivitas Taq polymerase tergantung dari jenisnya dan asal bakteri
tersebut diisolasi. Handoyo dan Rudiretna, 2000 d.
Nukleotida atau deoxyribonucleaside triphosphate dNTP Nukleotida merupakan bahan dasar untuk membentuk DNA
baru yang bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses pemanjanan DNA Rahman et. al., 2013. Ia terdiri
atas dATP, dTTP, dGTP, dan dCTP. dNTP akan menempel pada gugus
–OH pada ujung 3’ dari primer, kemudian membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA template.
e. Dapar dan MgCl
2
Dapar dibutuhkan untuk menjaga pH medium tetap berada pada pH yang sesuai agar proses PCR dapat berlangsung dan
menstabilkan enzim DNA polimerase. Sedangkan MgCl
2
yang menyediakan ion Mg
2+
bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi untuk menstimulasi aktivitas DNA polymerase. Dengan adanya
MgCl
2
ini akan meningkatkan interaksi primer dengan DNA template yang membentuk kompleks larut dengan dNTP.
Umumnya dapar PCR sudah mengandung senyawa MgCl
2
yang diperlukan. Namun, lebih disarakan agar dapat PCR dan MgCl
2
dipisahkan Handoyo dan Rudiretna, 2000. 2.7.2.
Tahapan PCR Tahapan PCR melibatkan 5 tahap, yaitu 1 pradenaturasi DNA
template; 2 denaturasi DNA template; 3 penempelan primer pada DNA template annealing; 4 pemanjangan primer extension, dan
5 pemantapan post-extension. Tahap 2 sampai 4 merupakan tahapan berulang siklus, dimana pada setiap siklus terjadi duplikasi
jumlah DNA. Tahapan PCR biasanya terdiri atas 20-35 siklus. Penggunaan jumlah siklus yang terlalu banyak dapat meningkatkan
jumlah produk yang non target.
