Proses Isolasi DNA HASIL DAN PEMBAHASAN

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 4.1. Hasil Kemurnian dan Kadar Isolat DNA yang Diperoleh No. Isolat Kemurnian A260A280 Kadar ngµl 1 Daging Sapi 2.003 75.88 2 Daging Babi 1.882 59.74 3 Gelatin Sapi 1.695 48.77 4 Gelatin Babi 1.519 11.78 5 Simulasi Cangkang Kapsul Keras Sapi 2.006 3.988 6 Simulasi Cangkang Kapsul Keras Babi 1.31 4.224 7 Sampel A 1.589 2.693 8 Sampel B 1.843 4.372 9 Sampel C 1.854 4.342 10 Sampel D 1.725 2.617 11 Sampel E 1.697 2.435 Isolat DNA dikatakan murni atau bebas dari protein jika kemurniannya berkisar antara 1.8-2.0 Greene dan Rao, 1998. Jika kemurnian isolat DNA lebih kecil dari 1.8 artinya isolat terkontaminasi oleh protein, sedangkan jika kemurnian isolat DNA lebih dari 2 artinya senyawa guanidine-HCl yang digunakan pada saat proses isolasi masih ada Pranawaty et.al., 2012; Branquinho et. al., 2012. Hasil kemurnian yang diperoleh dari setiap isolat DNA kontrol adalah 2.003 untuk daging sapi; 1.882 untuk daging babi; 1.695 untuk gelatin sapi; 1.519 untuk gelatin babi; 2.006 untuk simulasi cangkang kapsul sapi; dan 1.31 untuk simulasi cangkang kapsul babi. Sedangkan kemurnian dari setiap isolat DNA sampel adalah 1.589 untuk sampel A; 1.843 untuk sampel B; 1.854 untuk sampel C; 1.725 untuk sampel D; dan 1.697 untuk sampel E. Isolat sampel A dan isolat sampel E dapat dikatakan murni, karena memiliki kemurnian dalam rentang 1.8-2.0. Meskipun begitu, isolat DNA yang memiliki kemurnian diatas 1.0 masih dapat diterima dan dapat dilanjutkan ke proses amplifikasi pada RT-PCR Kusumadewi et.al., 2012. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Hasil kadar yang diperoleh dari setiap isolat DNA kontrol adalah 75.88 ngµl untuk daging sapi; 59,74 ngµl untuk daging babi; 48.77 ngµl untuk gelatin sapi; 11.78 ngµl untuk gelatin babi; 3.988 ngµl untuk simulasi cangkang kapsul sapi; dan 4.224 ngµl untuk simulasi cangkang kapsul babi. Sedangkan kadar dari setiap isolat DNA sampel adalah 2.693 ngµl untuk sampel A; 4.372 ngµl untuk sampel B; 4.342 ngµl untuk sampel C; 2.617 ngµl untuk sampel D; dan 2.435 ngµl untuk sampel E. Kadar simulasi cangkang kapsul dan kadar sampel berkisar antara 2.0-4.5 ngµl atau lebih kecil jika dibandingkan dengan kadar gelatin dan daging. Hal ini disebabkan karena pada simulasi cangkang kapsul dan sampel, gelatin yang digunakan sebagai bahan baku telah mengalami berbagai proses yang dapat menyebabkan degradasi DNA yang ada, seperti pemanasan pada suhu tinggi Demirhan et. al, 2012. Selain itu jika dibandingkan dengan DNA pada daging yang belum mengalami proses pengolahan, kadar DNA pada gelatin akan berjumlah lebih sedikit. Hal ini disebabkan karena gelatin telah mengalami proses lebih lanjut dari bahan asalnya kolagen yang dapat menyebabkan degradasi DNA Puspitaningrum, 2014. Namun dengan jumlah kadar tersebut, semua isolat DNA tetap dapat dilanjutkan untuk proses amplifikasi menggunakan RT-PCR. Hal ini disebabkan karena RT-PCR cukup sensitif dan dapat mendeteksi sampai dengan kadar 1 pgml Cai et. al., 2011.

4.5. Amplifikasi Menggunakan Real-Time PCR

Isolat DNA yang didapat kemudian diamplifikasi menggunakan RT-PCR. Proses amplifikasi DNA ini membutuhkan beberapa komponen, yaitu probe dan sepasang primer; isolat DNA sebagai DNA template yang akan diamplifikasi; enzim Taq Polymerase, buffer, MgCl 2 dan dNTP yang terkandung dalam LC 480 Probe Master. Primer yang digunakan diidentifikasi secara in silico dengan bantuan website BLAST NCBI. Berdasarkan hasil BLAST, primer sapi yang digunakan spesifik hanya untuk sapi Bos taurus Lampiran 3. Sedangkan untuk primer babi, terdapat beberapa spesies yang memiliki urutan pasang basa yang mirip, yaitu babi Sus scrofa, nyamuk Phlebotomus perniciosus, dan landak afrika Atherurus UIN Syarif Hidayatullah Jakarta africanus Lampiran 4. Namun jika dilihat dari spesies dan lokasi adanya spesies tersebut, yang mungkin diambil bagian tubuhnya dan dijadikan sumber gelatin hanya babi Sus scrofa. Sehingga, primer tersebut dapat digunakan untuk mendeteksi kandungan babi pada sampel. Proses amplifikasi DNA dalam penelitian ini dilakukan dengan metode Hydrolysis Probe. Prinsip kerja metode ini adalah berdasarkan flouresen yang dihasilkan oleh reporter FAM yang sebelumnya diredam oleh quencher BHQ1. Metode Hydrolysis Probe ini dilakukan dalam 3 tahap, yaitu Pre- Incubation yang berguna untuk mengaktivasi enzim polimerase yang terkandung dalam LC 480 Probe Master, Amplifikasi dari DNA target yang terdiri atas 3 proses denaturation, annealing, extention, dan Cooling untuk mengembalikan kondisi alat seperti semula. Masing-masing tahapan membutuhkan suhu dan waktu yang berbeda-beda sesuai kondisi optimalnya. Sebelum melakukan amplifikasi pada RT-PCR, harus disiapkan terlebih dahulu PCR mix yang terdiri atas primer forward, primer reverse, probe, dan LC 480 Probe Master sebanyak 15 µl untuk setiap isolat DNA yang ingin diamplifikasi perhitungan pembuatan PCR mix tertera pada Lampiran 5. Gambar 4.4. Hasil Amplifikasi Isolat DNA sampel menggunakan Primer Sapi. Keterangan: db = daging babi, gb = gelatin babi, sb = simulasi cangkang kapsul babi, ds=daging sapi, gs = gelatin sapi, dan ss = simulasi cangkang kapsul sapi