Isolasi rizobakteri dilakukan dari rizosfir tanaman padi dan serealia lainnya seperti jagung, rumput gajah, alang-alang dll. Pengambilan sampel rizosfir
tanaman padi dan serealia lainnya dilakukan di beberapa daerah di Bali. Pengambilan sampel dari rizosfir tanaman padi dilakukan untuk aneka jenis padi
lokal dan padi unggul yang dibudidayakan pada saat sampling dilakukan. Pada setiap lokasi pengambilan sampel diambil sebanyak 3 titik sampel untuk tanaman
padi dan 3 titik sampel untuk tanaman serealia lainnya. Berat masing-masing sampel sekitar 20 gram tanah rizosfir akar dan tanah yang melekat pada akar.
Sebanyak 10 gram sampel dimaserasi pada mortal kemudian diencerkan dengan 100 ml bufer posfat salin PBS. Selanjutnya dibuat seri pengenceran dengan PBS
sampai pengenceran 10
-7
. Media yang digunakan untuk mengisolasi rizobakteri adalah media
tryptic soy agar
TSA, dengan komposisi per liter : 3,0 g ekstrak daging; 3,0 g ekstrak yeast; 15,0 g pepton dari casein; 5,0 g pepton dari daging; 10 g laktose; 1,0 g
glukose; 10 g sukrose; 0,5 g NH3
+
Fe
3+
citrat; 5 g NaCl; 0,5 g sodium thiosulfat; 0,024 g phenol red; 12 g agar dan air dengan total volume media 1.000 ml. Ph
media diatur 7,4. Media ini ditambahkan benomyl 20 mgml atau Nystatin 50 mgliter untuk mengurangi pertumbuhan jamur Basham
et al
., 1993.
3.4. Uji Kemampuan Rizobakteri untuk Memacu Pertumbuhan Bibit Padi Lokal Bali
Semua isolat rizobakteri yang diperoleh diuji kemampuannya untuk meningkatkan jumlah bulu akar dan memacu pertumbuhan bibit padi. Padi
varietas Cicih Medang Putih digunakan pada pengujian ini karena mudah didapat dan pertumbuhannya relatif cepat umurnya genjah. Benih padi direndam terlebih
dahulu dengan air steril selama 24 jam, kemudian ditiriskan dan ditempatkan pada cawan Petri yang diberi kertas saring Whatman No.2 yang dibasahi dengan air
steril. Permukaan benih ditutup dengan kertas saring Whatman No. 2 basah dan dibiarkan selama 24 jam. Benih yang sudah mulai berkecambah selanjutnya
direndam dengan suspensi rizobakteri mengandung 10
7
CFUml dan dikeringanginkan selama 1 jam di dalam Laminar Flow. Benih kemudian
ditumbuhkan di dalam tabung reaksi yang berisi air steril dan KNO
3
sebanyak
0,01. Sebanyak 3 tabung reaksi disiapkan untuk masing-masing isolat yang diuji. Biakan ini dipelihara pada rak kultur dengan 12 jam penyinaran dengan
sinar fluorescens pada suhu 28 + 2
o
C. Pertumbuhan akar dan batang diamati selama 10 hari dan dibandingkan dengan kultur tanpa perlakuan rizobakteri.
3.5. Pengujian Kemampuan Rizobakteri untuk Menginduksi Ketahanan
Isolat rizobakteri yang menunjukkan kemampuan memacu pembentukan bulu akar dan merangsang pertumbuhan tanaman padi diuji kemampuannya untuk
menginduksi ketahanan terhadap pentakit blas. Pengujian dilakukan dengan tahapan sebagai berikut :
Benih padi yang digunakan adalah varietas Padi Merah Penebel yang dibuktikan paling rentan terhadap penyakit blas. Benih padi direndam dengan air bersih
selama 24 jam, kemudian ditiriskan dan diperam selama 24 jam agar benih mulai berkecambah. Benih ini kemudian direndam dengan suspensi rizobakteri 10
6
CFUml selama 30 menit. Benih yang hanya direndam dengan air steril digunakan sebagai kontrol. Benih kemudian ditanam pada cup plastic dengan
diameter permukaan 5,5 cm, tinggi 4 cm yang sudah diisi media berupa tissue basah steril yang ditambahkan larutan nutrisi 1 KNO3. Sebanyak 5 benih
ditanam pada setiap cup dan sebanyak 3 cup disiapkan untuk setiap isolate yang diuji. Tanaman dipelihara di dalam rak kultur jaringan dengan penyinaran
florescens selama 12 jam per hari dan suhu 28
o
C. Bibit yang berumur 9 hari diinokulasi dengan suspensi
P. oryzae
1 x 10
5
sporaml secara merata di seluruh permukaan bibit menggunakan
hand sprayer
mini. Setelah inokulasi, tanaman dipelihara di dalam
growth chamber
dengan RH 90 dan suhu 28
o
C selama 48 jam. Tanaman selanjutnya dikeluarkan dari growth chamber dan dipelihara pada
rak kultur dengan penyinaran florescens selama 12 jam. Gejala penyakit blas diamati setiap hari untuk memilih isolate mana yang mampu menginduksi
ketahanan tanaman padi terhadap penyakit blas dengan membandingkan intensitas penyakit pada perlakuan rizobakteri dengan kontrol.
3.6. Identifikasi Rizobakteri
