0,01. Sebanyak 3 tabung reaksi disiapkan untuk masing-masing isolat yang diuji. Biakan ini dipelihara pada rak kultur dengan 12 jam penyinaran dengan
sinar fluorescens pada suhu 28 + 2
o
C. Pertumbuhan akar dan batang diamati selama 10 hari dan dibandingkan dengan kultur tanpa perlakuan rizobakteri.
3.5. Pengujian Kemampuan Rizobakteri untuk Menginduksi Ketahanan
Isolat rizobakteri yang menunjukkan kemampuan memacu pembentukan bulu akar dan merangsang pertumbuhan tanaman padi diuji kemampuannya untuk
menginduksi ketahanan terhadap pentakit blas. Pengujian dilakukan dengan tahapan sebagai berikut :
Benih padi yang digunakan adalah varietas Padi Merah Penebel yang dibuktikan paling rentan terhadap penyakit blas. Benih padi direndam dengan air bersih
selama 24 jam, kemudian ditiriskan dan diperam selama 24 jam agar benih mulai berkecambah. Benih ini kemudian direndam dengan suspensi rizobakteri 10
6
CFUml selama 30 menit. Benih yang hanya direndam dengan air steril digunakan sebagai kontrol. Benih kemudian ditanam pada cup plastic dengan
diameter permukaan 5,5 cm, tinggi 4 cm yang sudah diisi media berupa tissue basah steril yang ditambahkan larutan nutrisi 1 KNO3. Sebanyak 5 benih
ditanam pada setiap cup dan sebanyak 3 cup disiapkan untuk setiap isolate yang diuji. Tanaman dipelihara di dalam rak kultur jaringan dengan penyinaran
florescens selama 12 jam per hari dan suhu 28
o
C. Bibit yang berumur 9 hari diinokulasi dengan suspensi
P. oryzae
1 x 10
5
sporaml secara merata di seluruh permukaan bibit menggunakan
hand sprayer
mini. Setelah inokulasi, tanaman dipelihara di dalam
growth chamber
dengan RH 90 dan suhu 28
o
C selama 48 jam. Tanaman selanjutnya dikeluarkan dari growth chamber dan dipelihara pada
rak kultur dengan penyinaran florescens selama 12 jam. Gejala penyakit blas diamati setiap hari untuk memilih isolate mana yang mampu menginduksi
ketahanan tanaman padi terhadap penyakit blas dengan membandingkan intensitas penyakit pada perlakuan rizobakteri dengan kontrol.
3.6. Identifikasi Rizobakteri
Sebanyak 3 tiga isolat rizobakteri yang menunjukkan kemampuan paling baik untuk memacu pertumbuhan bulu akar tanaman padi dan dapat menginduksi
ketahanan terhadap penyakit blas diidentifikasi untuk menentukan spesies. Identifikasi diawali dengan mengamati morfologi dan pertumbuhan koloni. Uji
gram dilakukan untuk menentukan apakah rizobakteri yang diperoleh bersifat gram gegatif atau gram positif. Koloni diwarnai dengan pewarna gram purple
cristal selama 1 menit, yodium selama 1 menit, alkohol 90 selama 30 detik dan safranin selama 30-60 detik. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop dengan
pembesaran 400 kali. Pengujian sifat fisiologis rizobakteri dilakukan menggunakan uji
Microbact Oxoid Microbact
tm
GNB Kits. Biakan rizobakteri yang berumur 18- 24 jam digunakan untuk uji ini. Pertama dilakukan uji oksidasi dengan
memasukkan 4 tetes biakan rizobakteri ke dalam lubang tray, ditambahkan 2 tetes minyak mineral ke lubang berwarna hitam. Inkubasi selama 18-24 jam pada suhu
35
o
C. Bila positif oksidatif, berwarna biru atau ungu. Untuk kelompok oksidasi positif digunakan Microbact 12E dan 12B, sedangkan untuk kelompok oksidasi
negatif hanya menggunakan Microbact 12E. Identifikasi secara molekuler dilakukan dengan mengamplifikasi gen 16S-
rRNA dengan PCR. Primer yang digunakan adalah primer universal untuk bakteri berupa forward primer 63f 5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’ dan
reverse primer 1387r 5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’ Marchesi
et al
., 1998. Kondiri PCR yang digunakan adalah Pre-PCR pada suhu 94
o
C selama 2 menit, denaturasi pada suhu 92
o
C selama 30 detik, annealing primer pada suhu 55
o
C selama 30 detik, elongation pada suhu 75
o
C selama 1 menit, dan post-PCR pada suhu 75
o
C selama 5 menit dengan jumlah siklus sebanyak 30 kali. Pemisahn DNA produk PCR pada elektroforesis mini gel dengan menggunakan agarose 2
bv pada teganagan listrik 50 volt selama 45 menit. Visualisasi dengan thidium bromide dan dilihat di bawah UV transluminator. Sekuensing dilakukan dengan
alat Automated DNA sequencer ABI PRISM 377 Perkin Elmer Biosystem, USA. Hasil sekuensing kemudian dijajarkan dengan data GenBank
menggunakan program BLAST-N
basic local alignment search tool-nucleotide
