UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3 PROSEDUR KERJA 3.3.1 Pengamatan Karakteristik Ekstrak
a. Identitas Ekstrak dideskripsikan tata nama yang meliputi nama ekstrak nama latin
tumbuhan, bagian tumbuhan yang digunakan dan nama Indonesia tumbuhan.
b. Organoleptis Ekstrak dideskripsikan dengan menggunakan pancaindera untuk mengetahui
bentuk, warna, bau, dan rasa.
3.3.2 Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etil Asetat secara Kualitatif
Menggunakan KLT
Uji kualitatif antioksidan dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis KLT. Ekstrak etil asetat dilarutkan didalam pelarut etil asetat,
kemudian dibuat larutan DPPH dengan konsentrasi 0,04 dalam 20 mL metanol dengan cara menimbang 8 mg serbuk DPPH, kemudian dilarutkan dalam 20 mL
metanol pro analisis. Ekstrak yang telah dilarutkan ditotolkan ke plat KLT yang telah disiapkan sebelumnya. Setelah penotolon selesai, plat KLT dielusi didalam
chamber dengan fase gerak n-heksan etil asetat dengan perbandingan 65:35. Setelah itu dikeringkan selama 10 menit dan kemudian diseprot dengan penampak
bercak DPPH 0,04 hingga plat KLT terbasahi. Plat KLT yang telah disemprot dibiarkan selama 30 menit dalam ruangan tertutup. Selanjutnya dilihat pola bercak
yang memberikan aktivitas antioksidan pada plat KLT, dengan melihat perubahan warna bercak menjadi kuning terang.
3.3.3 Isolasi Senyawa Aktif Antioksidan dengan Kromatografi Kolom
Ekstrak etil asetat yang positif mengandung senyawa antioksidan dilakukan fraksinasi dengan metode kromatografi kolom. Kolom kromatografi
yang digunakan memiliki ukuran tinggi 100 cm dan diameter 5 cm. Kolom kromatografi disiapkan dan dipasang dengan menjepit kolom menggunakan statif.
Setelah itu silika gel dimasukkan ke dalam kolom sampai setengah dari kolom kromatografi. Kemudian silika dikeluarkan lagi dari kolom dan ditimbang untuk
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
mengetahui berapa banyak silika yang terpakai untuk kolom kromatografi. Setelah dilekuarkan dan ditimbang berat silika yang terpakai adalah 247 gram. Tahap
selanjutnya kolom kromatografi disumbat bagian bawahnya dengan menggunakan kapas. Setelah itu pelarut n-heksan dimasukkan ke dalam kolom dan kapas
ditekan-tekan agar tidak ada gelembung udara yang terjerap. Silika gel seberat 247 gram dibuat bubur silika dengan ditambahkan
pelarut n-heksan dan diaduk hingga menjadi bubur. Bubur silika gel dimasukkan ke dalam kolom kromatografi secara perlahan-lahan. Setelah itu kolom dialiri
dengan pelarut n-heksan, pelarut n-heksan yang menetes ditampung, kemudian dimasukkan kembali ke dalam kolom sambil diketuk-ketuk sampai silika gel
mampat. Tahap selanjutnya, ekstrak etil asetat sebanyak 35 gram dicampur dengan silika gel sebanyak 15 gram untuk preadsorbsi. Ekstrak dimasukkan ke
dalam kolom dan permukaan atas ekstrak ditutup dengan kapas. Kemudian dibuat sistem fase gerak dengan komposisi n-heksan dan etil
asetat dengan berbagai perbandingan. Sistem fase gerak yang digunakan adalah sistem gradien. Fraksinasi pertama dilakukan dengan mengaliri kolom dengan
fase gerak n-heksan 100. Pelarut yang menetes dari kolom ditampung dalam vial yang sebelumnya telah ditimbang dan diberi nomor. Penggantian gradien fase
gerak dilakukan ketika gradien sebelumnya telah habis digunakan untuk mengaliri kolom. Jumlah perbandingan pelarut n-heksan dan etil asetat yang digunakan
selannjutnya adalah 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9, sampai etil asetat 100.
Fraksinasi dilakukan hingga fase gerak yang digunakan telah mencapai gradien akhir yaitu etil asetat 100. Pada tahap akhir kromatografi kolom, kolom
dicuci dengan mengaliri pelarut metanol 100 untuk membersihkan silika gel
dari sisa ekstrak yang masih menempel.
Fraksi-fraksi yang diperoleh ditampung dan kemudian diuapkan menggunakan rotary evaporator. Seluruh fraksi yang diperoleh diidentifikasi
dengan kromatografi lapis tipis KLT dengan eluen n-heksan-etil asetat dengan berbagai perbandingan. Kemiripan bercak yang timbul pada lempeng diamati baik
secara langsung maupun di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 serta disemprot dengan larutan DPPH. Fraksi yang mempunyai kemiripan bercak
