Metode Reducing Power Uji Aktivitas Antioksidan .1 Metode DPPH

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta mengetahui berapa banyak silika yang terpakai untuk kolom kromatografi. Setelah dilekuarkan dan ditimbang berat silika yang terpakai adalah 247 gram. Tahap selanjutnya kolom kromatografi disumbat bagian bawahnya dengan menggunakan kapas. Setelah itu pelarut n-heksan dimasukkan ke dalam kolom dan kapas ditekan-tekan agar tidak ada gelembung udara yang terjerap. Silika gel seberat 247 gram dibuat bubur silika dengan ditambahkan pelarut n-heksan dan diaduk hingga menjadi bubur. Bubur silika gel dimasukkan ke dalam kolom kromatografi secara perlahan-lahan. Setelah itu kolom dialiri dengan pelarut n-heksan, pelarut n-heksan yang menetes ditampung, kemudian dimasukkan kembali ke dalam kolom sambil diketuk-ketuk sampai silika gel mampat. Tahap selanjutnya, ekstrak etil asetat sebanyak 35 gram dicampur dengan silika gel sebanyak 15 gram untuk preadsorbsi. Ekstrak dimasukkan ke dalam kolom dan permukaan atas ekstrak ditutup dengan kapas. Kemudian dibuat sistem fase gerak dengan komposisi n-heksan dan etil asetat dengan berbagai perbandingan. Sistem fase gerak yang digunakan adalah sistem gradien. Fraksinasi pertama dilakukan dengan mengaliri kolom dengan fase gerak n-heksan 100. Pelarut yang menetes dari kolom ditampung dalam vial yang sebelumnya telah ditimbang dan diberi nomor. Penggantian gradien fase gerak dilakukan ketika gradien sebelumnya telah habis digunakan untuk mengaliri kolom. Jumlah perbandingan pelarut n-heksan dan etil asetat yang digunakan selannjutnya adalah 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9, sampai etil asetat 100. Fraksinasi dilakukan hingga fase gerak yang digunakan telah mencapai gradien akhir yaitu etil asetat 100. Pada tahap akhir kromatografi kolom, kolom dicuci dengan mengaliri pelarut metanol 100 untuk membersihkan silika gel dari sisa ekstrak yang masih menempel. Fraksi-fraksi yang diperoleh ditampung dan kemudian diuapkan menggunakan rotary evaporator. Seluruh fraksi yang diperoleh diidentifikasi dengan kromatografi lapis tipis KLT dengan eluen n-heksan-etil asetat dengan berbagai perbandingan. Kemiripan bercak yang timbul pada lempeng diamati baik secara langsung maupun di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 serta disemprot dengan larutan DPPH. Fraksi yang mempunyai kemiripan bercak UIN Syarif Hidayatullah Jakarta digabung menjadi satu. Fraksinasi dilakukan kembali sampai didapatkan hasil berupa isolat murni.

3.3.4 Identifikasi Senyawa Murni

Identifikasi kemurnian senyawa dengan menggunakan 2 metode antara lain kromatografi lapis tipis 2 dimensi KLT 2 dimensi dan uji titik leleh.

1. Kromatografi Lapis tipis 2 dimensi KLT 2 Dimensi

Dibuat plat KLT dengan bentuk bujur sangkar yang setiap sisinya memiliki ukuran 5 cm. Kemudian kristal dilarutkan dengan etil asetat dan ditotolkan pada salah satu sisi plat dengan pipa kapiler, selanjutnya plat KLT dielusi dengan fase gerak n-heksan dan etil asetat 65:35 dan dibiarkan kering sesaat. Kemudian plat KLT dielusi kembali pada sisi lainnya dengan menggunakan fase gerak yang sama, bercak dilihat dibawah lampu UV dan disemprot dengan pereaksi DPPH 0,04.

2. Uji Titik Leleh

Pengujian titik leleh dengan menggunakan alat melting point. Satu kristal jarum panjang dari isolat dimasukkan ke dalam pipa kapiler yang telah ditutup pada salah satu ujungnya kemudian diketuk-ketuk hingga kristal turun ke bawah. Selanjutnya Pipa kapiler dimasukkan ke dalam alat melting point dan temperatur dinaikkan secara perlahan-lahan. Lazimnya setiap menit temperatur dinaikkan sebanyak 1 C. Titik leleh ditandai pada saat kristal mulai meleleh hingga meleleh sempurna. Senyawa dikatakan murni apabila memiliki titik leleh dengan rentang ± 2 C. Gambar 3.1 KLT 2 Dimensi