Bahan Alat Tata Cara Penelitian

D. Bahan

1. Daun sirih merah yang diperoleh dari daerah Pekunden Rt.02Rw.09, Ngluar, Magelang. 2. Kultur murni Candida albicans ATCC 10231 yang diperoleh dari Balai Laboratorium Kesehatan Yogyakarta. 3. Medium SDA, aquadest steril untuk penyari, injeksi ketokonazole, metanol, selulosa, silika gel GF 254, n-butanol, asam asetat, air, kloroform, toluene, eter, etanol, natrium karbonat, tertier butanol, dietil amina, toluena, etil asetat, pereaksi Lieberman-Burchard. Pereaksi semprot : Dragendorff, Mayer, dan vanilin-asam sulfat. Pembanding : asam tanat, rutin, HCl, NaCl 2, besi III klorida, AlCl 3 .

E. Alat

Panci, inkubator Memmert, type BE 40, GmbH+Co KG-D91126, Swahaban FRG, Germany, Mycrobiologycal Safety Cabinet MSC, Rotary evaporator Janke Kunkel, Ika-labotechnik, RV05-ST, autoklaf Metode KT- 40, ALP co, Ltd, Hamurashi, Tokyo, Japan, lampu UV 254 nm dan UV 365 nm, oven Memmert, Germany, penyerbuk Retsch bv, Electric Sieve Shaker IML Indotest Multi LAB, Laminar Air Flow LAF, Lemari pendingin Sharp, Glass beaker pyrex, cawan petri, tabung reaksi pyrex, Erlenmeyer pyrex, flakon, pipet volume pyrex, batang pengaduk, gelas ukur pyrex, jarum ose, Mikropipet Ependrof-Netler-Hinz, kertas payung, allumunium foil, kompor listrik, vortex, spreader , jangka sorong Vernier caliper, Shanghai, China, lampu Bunsen, plat PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI KLT, pipa kapiler, penyemprot reagen tampak, bejana, neraca analitik Mettler PC 2000.

F. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman Determinasi tanaman sirih merah dilakukan oleh Laboratorium Farmakognosi, Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gajah Mada Yogyakarta. Determinasi dilakukan terhadap tanaman segar dengan menggunakan acuan Flora of Java Backer dan Van den Brink, 1965. 2. Pengumpulan bahan Bahan yang digunakan berupa daun sirih merah, diambil dari tanaman sirih merah di daerah Pekunden Rt.02Rw.09, Ngluar, Magelang pada bulan November. Daun yang diambil adalah daun yang tidak terlalu muda ataupun terlalu tua. Daun tersebut dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang melekat. Daun dikeringkan dalam oven dengan suhu 50°C. Setelah kering, lalu diserbuk dengan blender sampai halus dan diayak menggunakan ayakan. 3. Pembuatan Infusa Infusa dibuat dengan mengekstraksi sebanyak 10 gram serbuk kering daun sirih merah lalu dimasukkan dalam panci dengan air sebanyak 100 ml, panaskan diatas tangas air selama 15 menit terhitung mulai suhu mencapai 90°C sambil sekali-kali diaduk. Kemudian setelah dingin diserkai melalui kain flannel lalu ditambahkan air secukupnya melalui ampas hingga diperoleh volume infusa yang dikehendaki kurang lebih 25 ml. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 4. Uji Kandungan Kimia dengan Uji Tabung a. Uji Alkaloid Infusa dari serbuk daun sirih merah sebanyak 2 gram dipanaskan dalam tabung reaksi besar dengan asam klorida 1 10 ml selama 30 menit diatas penangas air mendidih. Larutan disaring dengan kapas ke dalam tabung reaksi A dan B sama banyak. Larutan A dibagi dua sama banyak, lalu kedalam larutan A-1 ditambah dengan pereaksi Dragendorf 3 tetes dan larutan A-2 ditambah pereaksi Mayer 3 tetes. Terbentuknya endapan dengan kedua pereaksi tersebut menunjukkan adanya alkaloid b. Uji Tanin Infusa dari serbuk daun sirih merah sebanyak 2 gram dipanaskan dengan air sebanyak 10 ml selama 30 menit diatas tangas air. Disaring dan filtrat sebanyak 5ml ditambahkan larutan natrium klorida 2 sebanyak 1 ml. Bila terjadi suspensi atau endapan disaring melalui kertas saring. Kemudian filtrat ditambah larutan gelatin 1 sebanyak 5 ml. Terbentuknya endapan menunjukkan adanya tanin. c. Uji flavonoid Infusa dari serbuk daun sirih sebanyak 2 gram dipanaskan dengan air sebanyak 10 ml selama 10 menit diatas penangas air mendidih. Kemudian disaring panas-panas, setelah dingin ditambah 3 tetes pereaksi besi III klorida. Terjadinya warna hijau-biru menunjukkan adanya flavonoid. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI d. Uji Minyak Atsiri Serbuk daun sirih merah ditambahkan 20 ml eter, kocok dan disaring. Kemudian filtrat dikeringuapkan. Bila sedikit berbau aromatik, larutan residu dengan sedikit etanol maka uapkan lagi sampai kering. Bila terjadi bau aromatik spesifik, menunjukkan adanya minyak atsiri. e. Uji Antrakinon Infusa daun sirih merah dididihkan selama 2 menit dengan Kalium hidroksida 0,5N 10ml dan larutan hidrogen peroksida 1ml. Setelah dingin suspensi disaring melalui kapas. Filtrat 5ml ditambah asam asetat 10 tetes sampai pH 5, lalu ditambahkan toluena 10ml. Lapisan atas 5ml dipisahkan dengan cara dipipet dan dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian ditambah kalium hidroksida 0,5N, warna merah yang terjadi pada lapisan air basa menunjukkan adanya senyawa antrakinon. f. Uji Kardenolida Infusa dari serbuk daun sirih sebanyak 2 gram dipanaskan dengan air sebanyak 10 ml selama 10 menit diatas penangas air mendidih. Kemudian ditambah asam 3,5-dinitratbenzoat 0,4ml dan kalium hidroksida 1N 0,6ml dalam metanol. Terjadinya warna biru-ungu menunjukkan adanya kardenolida glikosida jantung. Untuk penegasan lebih lanjut, filtrat yang lain 2ml dicampur dengan kloroform 2 ml. Lapisan atas diambil dengan pipet, lapisan bawah ditambah asam 3,5- dinitrobenzoat 0,5 ml. Terjadinya warna biru-ungu menunjukkan adanya kardenolida. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI g. Uji Saponin Tambahkan air suling 10ml kedalam tabung reaksi yang berisi serbuk 100mg, tutup dan kocok kuat-kuat selama 30 detik. Biarkan tabung dalam posisi tegak selama 30 menit. Apabila buihh setinggi kurang lebih 3 cm dari permukaan cairan, maka menunjukkan adanya saponin. Uji lain dilakukan dengan menggunakan pipa kapiler diameter 1 mm, panjang 12,5 cm. Larutan hasil pemanasan serbuk daun sirih merah 2 g dengan air 10 ml selama 30 menit diatas tangas air, setelah disaring, filtrat dimasukkan kedalam pipa kapiler penuh-penuh. Kapiler diletakkan dalam posisi tegak vertikal, kemudian cairan dibiarkan mengalir bebas. Tinggi cairan tertinggal dibandingkan dengan tinggi air suling yang diperlakukan sama. Bila tinggi cairan yang diuji separo atau kurang dari tinggi air suling maka adanya saponin akan diperhitungkan. 5. Uji Kandungan Kimia dengan Kromatografi Lapis Tipis a. Uji Flavonoid Proses pemisahan dilakukan dengan menotolkan infusa daun sirih merah dengan konsentrasi 100 menggunakan pipa kapiler berukuran 5 μl pada lempeng KLT. Fase diam yang digunakan adalah selulosa, fase gerak n-butanol: asam asetat: air 4:1:5 vv. Sampel yang digunakan adalah infusa daun sirih merah dan pembandingnya rutin. Selanjutnya adalah pengelusian lempeng dengan jarak rambat 10 cm. Pengamatan dilakukan di bawah sinar UV 254 nm dan 365 nm dan dideteksi dengan pereaksi AlCl 3 . Harga Rf dan warna bercak uji dibandingkan dengan harga rf dan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI warna bercak pembanding. Adanya harga rf dan warna bercak yang hampir serupa menunjukkan bahwa bahan uji mengandung senyawa Flavonoid. b. Alkaloid Proses pemisahan dilakukan dengan menotolkan infusa daun sirih merah dengan konsentrasi 100 menggunakan pipa kapiler berukuran 5 μl pada lempeng KLT. Fase diam yang digunakan adalah silika gel GF 254, fase gerak tertier butanol: kloroform: dietil amina 2:7:1 vv. Sampel yang digunakan infusa daun sirih merah dan pembandingnya skopolamin. Untuk pembuatan pembanding digunakan 5 mg skopolamin dalam 10 ml metanol. Selanjutnya adalah pengelusian lempeng dengan jarak rambat 10 cm. Pengamatan dilakukan di bawah sinar UV 254 nm dan 365 nm dan dideteksi dengan pereaksi Dragendorff. Harga Rf dan warna bercak uji dibandingkan dengan Rf dan warna bercak pembanding. Adanya harga Rf yang hampir serupa menunjukkan bahwa bahan uji mengandung senyawa alkaloid. b. Uji Tanin Proses pemisahan dilakukan dengan menotolkan infusa daun sirih merah dengan konsentrasi 100 menggunakan pipa kapiler berukuran 5 μl pada lempeng KLT. Fase diam yang digunakan adalah silika gel GF 254, fase gerak n-butanol: asam asetat: air 5:1:4 vv. Pembanding yang digunakan adalah asam tanat 0,05 dalam etanol 70. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Selanjutnya adalah pengelusian lempeng dengan jarak rambat 10 cm. Pengamatan dilakukan di bawah sinar UV 254 nm dan 365 nm dan dideteksi dengan pereaksi FeCl 3 . Harga Rf dan warna bercak uji dibandingkan dengan Rf dan warna bercak pembanding. Adanya harga Rf yang hampir serupa menunjukkan bahwa bahan uji mengandung senyawa tanin. c. Minyak atsiri Proses pemisahan dilakukan dengan menotolkan infusa daun sirih merah menggunakan pipa kapiler berukuran 5 μl pada lempeng KLT. Fase diam yang digunakan adalah silika gel GF 254, fase gerak toluena: etil asetat 93:7 vv. Pembanding yang digunakan adalah eugenol. Selanjutnya adalah pengelusian lempeng dengan jarak rambat 10 cm. Pengamatan dilakukan di bawah sinar UV 254 nm dan 365 nm dan dideteksi dengan pereaksi vanillin-asam sulfat pekat. Harga Rf dan warna bercak uji dibandingkan dengan Rf dan warna bercak pembanding. Adanya harga Rf dan warna bercak yang hampir sama menunjukkan bahwa bahan uji mengandung senyawa minyak atsiri. 6. Uji antifungi a. Pembuatan larutan uji Larutan uji dibuat dari konsentrasi 100 yakni 10g serbuk daun sirih merah dalam aquadest 100ml. Selanjutnya dibuat konsentrasi larutan 80, 60, dan 40 dengan melakukan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI pengenceran sampai 10 ml dengan menggunakan aquadest. Sebagai kontrol positif digunakan ketokonazole dan kontrol negatif Aquades. Tabel I. Pembuatan tingkatan konsentrasi larutan uji dengan pengenceran Konsentrasi infusa Volume infusa ml Pelarut aquadest ml 80 8 2 60 6 4 40 4 6 b. Sterilisasi alat-alat dan bahan Alat-alat seperti cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer, dan medium SDA yang akan digunakan untuk pemeriksaan aktivitas antifungi disterilisasi dengan autoklaf, pada suhu 121°C selama 15 menit. c. Pembuatan media SDA Sebanyak 65 gram SDA dimasukkan kedalam erlenmeyer, ditambahkan dengan 1 liter aguadest dan dipanaskan hingga mendidih. Kemudian ditutup dengan menggunakan kapas, dan dimasukkan kedalam autoklaf untuk disterilkan pada suhu 121°C selama 15 menit dengan tekanan 1 atm. d. Pembuatan stok Candida albicans ATCC 10231 Media SDA yang sudah steril dicairkan kemudian dituang dalam tabung reaksi dan dimiringkan, biarkan hingga membeku. Setelah membeku diambil 1 ose fungi dari pertumbuhan dan diinokulasikan secara streak plate. Inkubasi dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37°C dan digunakan sebagai stok. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI e. Pengujian potensi antifungi dengan metode difusi paper disk Dalam Laminar Air Flow Work Station, hasil inkubasi jamur selama 24 jam dalam media cair diambil 0,1ml menggunakan pipet volume dan diteteskan kedalam cawan petri yang berisi SDA yang telah dibekukan dan diratakan dengan menggunakan spreader. Selanjutnya didiiamkan selama kurang lebih 15 menit, kemudian dibagi menjadi lima bagian dan masing-masing bagian diberi paper disk Anonim, 1993. Setiap paper disk pada media yang telah diinokulasi diteteskan 10µl infusa dengan kadar masing-masing 80, 60, 40. Sebagai kontrol negatifnya digunakan aquadest dan kontrol positifnya adalah ketokonazole. Media yang telah ditetesi infusa dan kontrol diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37˚C. Hasil dibaca dengan luas daerah hambatan Jawetz dkk, 1996. Lalu diukur dengan menggunakan penggaris. Pengulangan pengukuran masing-masing diameter sebanyak lima kali. f. Pengujian potensi antifungi dengan metode dilusi padat Diambil 1 ose fungi Candida albicans ATCC 10231 dari stok fungi, kemudian disuspensikan kedalam 5 ml media cair lalu campur rata dan inkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Hasil suspensi dibandingkan dengan Standard Mc. Farland II 6.10 8 CFUml ingá kekeruhannya sama lalu diambil 0,5 ml. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Kemudian 0,5 ml infusa daun sirih merah dengan kadar tertentu ditambahkan dalam 0,5 ml suspensi fungi dan dicampur rata dengan 15 ml SDA yang dicairkan menggunakan vortex. Setelah itu, dituang dalam cawan petri secara pour plate. Selanjutnya diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37°C. Setelah masa inkubasi, kekeruhan yang menunjukkan pertumbuhan Candida albicans ATCC 10231 dalam media diamati dan diberi penilaian menggunakan notasi + untuk media yang tampak keruh. Hal ini berlaku untuk tiap infusa daun sirih merah, kontrol negatif aquades dan kontrol positif ketokonazole. Hasil pengamatan dianalisis untuk mendapatkan Konsentrasi Hambat Minimun KHM senyawa uji dengan mengamati kekeruhannya Hugo Russel, 1987. Setelah ditentukan Kadar Hambat Minimum KHM, kemudian dilakukan streak plate pada media SDA yang telah dibekukan dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Jika sudah tidak terdapat pertumbuhan jamur uji pada media maka konsentrasi tersebut menunjukkan KBMnya Konsentrasi Bunuh Mikroba Larry Judy, 1996.

G. Tata Cara Analisa Data