19
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmasi yaitu Pharmacy Halal Food and Drugs PHA dan Pharmacy Natural Product Chemistry
PNA Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Mulai dari bulan Maret sampai Juni 2013.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan bahan, timbangan analitik, labu erlenmeyer, corong, kolom kromatografi,
vial, batang pengaduk, spatula, pipet tetes, pipet ukur, kertas saring, kapas, vacuum rotary evaporator Eyela N-1000, melting point, water bath
Eyela SB-1000, NMR 500 MHz, Jeol dan alat-alat gelas lainnya.
3.2.2 Bahan Uji
Bahan yang diteliti adalah tumbuhan lumut hati Mastigophora diclados Brid. ex Web. Nees Mastigophoraceae sebanyak 2,220 kg
yang diperoleh dari Hutan Gunung Slamet, Baturaden, Purwokerto, Jawa Tengah dan telah dideterminasi oleh Pusat Penelitian Bogoriense, LIPI
Cibinong, Bogor, Jawa Barat Lampiran 1.
3.2.3 Bahan Kimia
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah etil asetat teknis, n-heksana teknis, metanol teknis, etanol 96, HCl asam klorida,
amonia encer, H
2
SO
4
asam sulfat pekat, CHCl
3
kloroform, FeCl
3
besi klorida, lempeng KLT whatman, 250 µm 20 x20 cm AL SIL GUV,
Flexible Plates for TLC, cat No. 4420222, coating silica gel, silika gel 60 GF
254
0,063-0,200 mm for column chromatography Merck. Reagen kimia antara lain : Pereaksi Godin
’s reagen A ; 1 vanilin dilarutkan dalam etanol : 3 HClO
3
dalam aquadest, 1:1 dan reagen B ; 10 H
2
SO
4
, pereaksi Mayer, pereaksi Bouchardat dan pereaksi Dragendorff.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3 Cara Kerja Lampiran 5
3.3.1 Penyiapan Bahan
Sejumlah 2,220 kg lumut hati Mastigophora diclados Brid. ex
Web. Nees disortasi basah untuk dipisahkan dari kotoran-kotoran atau bahan-bahan asing sehingga dapat mengurangi jumlah pengotor yang ikut
terbawa dalam bahan uji, dicuci dengan air hingga bersih, ditiriskan agar bebas dari air sisa cucian, dikering anginkan dalam ruangan, setelah kering
dan bebas dari air, kemudian disortasi kering, ditimbang kemudian dihaluskan menggunakan blender hingga menjadi serbuk. Kemudian
simplisia disimpan dalam wadah bersih, kering dan terlindung dari cahaya. Adapun simplisia yang dihasilkan adalah sebanyak 2,103 kg.
3.3.2 Pembuatan Ekstrak
Sejumlah 2,103 kg serbuk simplisia kering Mastigophora diclados Brid. ex Web. Nees dimaserasi dengan pelarut n-heksana teknis yang
telah didestilasi. Maserasi dilakukan sebanyak 9 kali selama 9 hari dengan pelarut n-heksana sebanyak 30 liter. Hasil maserasi disaring dan filtrat
yang diperoleh dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator pada suhu lebih kurang 30
C, sehingga diperoleh ekstrak kental n-heksana. Terhadap ampas n-heksana dilakukan maserasi kembali dengan menggunakan
pelarut etil asetat sebanyak 7 kali selama 7 hari dan menghabiskan pelarut kurang lebih 25 liter, kemudian ekstrak disaring menggunaka kertas
saring, lalu pelarut diuapkan dengan vacuum rotary evaporator pada suhu lebih kurang 40
C hingga diperoleh ekstrak kental etil asetat, kemudian dihitung rendemennya terhadap berat simplisia awal.
3.3.3 Penapisan Fitokimia Ayoola, et al., 2008
Pada ekstrak etil asetat dilakukan pemeriksaan kandungan kimia antara lain pereaksi untuk alkaloid, flavonoid, terpenoid, saponin dan
fenolik. a.
Identifikasi Alkaloid
Sejumlah ekstrak dilarutkan dalam asam klorida encer, dipanaskan kemudian disaring. 5 mL filtrat ditambahkan dengan 2 mL
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
amonia dan 5 mL kloroform kemudian dikocok. Lapisan kloroform ditambahkan etil asetat 10 mL. Filtrat kemudian dibagi dua.
1. Uji Mayer : filtrat diberi reagen mayer, terbentuknya endapan
berwarna kuning menunjukkan adanya alkaloid. 2.
Uji Dragendroff : filtrat diberi reagen dragendroff, terbentuknya endapan merah menunjukkan adanya alkaloid.
b. Identifikasi Flavonoid
Tiga metode yang digunakan untuk menguji flavonoid. 1.
Amonia encer 5 mL ditambahkan ke sebagian filtrat encer dari ekstrak. Kemudian asam sulfat pekat 1 mL ditambahkan. Sebuah
warna kuning yang hilang menunjukkan adanya flavonoid. 2.
Beberapa tetes larutan aluminium 1 ditambahkan ke sebagian dari filtrat, terbentuknya warna kuning menunjukkan adanya
flavonoid. 3.
Sebagian dari ekstrak dipanaskan dengan 10 mL etil asetat yang telah diuapkan selama 3 menit. Campuran kemudian disaring dan 4
mL filtrat dikocok dengan penambahan 1 mL larutan amonia encer, terbentuknya warna kuning menunjukkan adanya flavonoid.
c. Identifikasi Terpenoid
Sejumlah ekstrak ditambahkan dengan 2 mL kloroform. Kemudian dengan hati-hati ditambahkan H
2
SO
4
pekat 3 mL sampai membentuk
lapisan. Terbentuknya
warna merah
kecoklatan menunjukkan adanya terpenoid.
d. Identifikasi Saponin
Sejumlah ekstrak ditambahkan 5 mL aquadest dalam tabung reaksi. Kemudian dikocok dan diamati. Terbentuknya busa yang stabil
menujukkan adanya saponin.
e. Identifikasi Fenolik
Sejumlah ekstrak dalam 10 mL air dididihkan dalam tabung reaksi kemudian disaring, beberapa tetes besi klorida 0,1
ditambahkan dan diamati, terbentuknya warna hijau kecoklatan atau biru-hitam menunjukkan adanya fenolik.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
f. Identifikasi Antraquinon
Sejumlah ekstrak dididihkan bersama asam sulfat H
2
SO
4
lalu disaring selagi hangat. Filtrat yang dihasilkan ditambah dengan 5 mL
kloroform dan dikocok. Lapisan kloroform dipipet dan dimasukkan kedalam tabung reaksi yang lain dan ditambahkan 1 mL amonia.
Perubahan warna yang terjadi pada larutan mengindikasikan adanya antraquinon.
3.3.4 Isolasi dan Pemurnian Senyawa
a. Pengujian dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT
Pengujian dengan KLT dilakukan dengan menggunakan plat silikagel 60 GF
254
sebagai fase diam. Plat silika gel dibuat dengan ukuran lebar 1 cm dan panjang 5 cm pada ujung atas dan bawah diberi
batas 0,5 cm. Untuk menentukan pengembang yang optimum, dicoba berbagai komposisi pengembang.
Ekstrak yang akan diuji sebanyak 10 mg dilarutkan dalam 10 mL pelarut yang digunakan pada ekstraksi sebelumnya larutan uji,
lalu ditotolkan sebanyak 20 µl pada titik awal pergerakan. Setelah totolan kering, dilakukan pengelusian di dalam bejana KLT yang telah
dijenuhkan dan ditutup rapat. Setelah eluen mencapai garis atas, lempeng dikeluarkan dan dikeringkan.
Bercak diamati secara visual, dengan lampu UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm, dan menggunakan pereaksi semprot
universal untuk menampakkan bercak yang tidak berwarna dan tidak berfluorosensi. Pereaksi semprot universal yang digunakan adalah
pereaksi Godin’s reagen A ; 1 vanilin dilarutkan dalam etanol μ 3 HClO
3
dalam aquadest, 1:1 dan reagen B ; 10 H
2
SO
4
yang dilanjutkan dengan pemanasan.
b. Pemisahan dengan Kromatografi Kolom
