Pemisahan dengan Kromatografi Kolom

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

f. Identifikasi Antraquinon

Sejumlah ekstrak dididihkan bersama asam sulfat H 2 SO 4 lalu disaring selagi hangat. Filtrat yang dihasilkan ditambah dengan 5 mL kloroform dan dikocok. Lapisan kloroform dipipet dan dimasukkan kedalam tabung reaksi yang lain dan ditambahkan 1 mL amonia. Perubahan warna yang terjadi pada larutan mengindikasikan adanya antraquinon.

3.3.4 Isolasi dan Pemurnian Senyawa

a. Pengujian dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT

Pengujian dengan KLT dilakukan dengan menggunakan plat silikagel 60 GF 254 sebagai fase diam. Plat silika gel dibuat dengan ukuran lebar 1 cm dan panjang 5 cm pada ujung atas dan bawah diberi batas 0,5 cm. Untuk menentukan pengembang yang optimum, dicoba berbagai komposisi pengembang. Ekstrak yang akan diuji sebanyak 10 mg dilarutkan dalam 10 mL pelarut yang digunakan pada ekstraksi sebelumnya larutan uji, lalu ditotolkan sebanyak 20 µl pada titik awal pergerakan. Setelah totolan kering, dilakukan pengelusian di dalam bejana KLT yang telah dijenuhkan dan ditutup rapat. Setelah eluen mencapai garis atas, lempeng dikeluarkan dan dikeringkan. Bercak diamati secara visual, dengan lampu UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm, dan menggunakan pereaksi semprot universal untuk menampakkan bercak yang tidak berwarna dan tidak berfluorosensi. Pereaksi semprot universal yang digunakan adalah pereaksi Godin’s reagen A ; 1 vanilin dilarutkan dalam etanol μ 3 HClO 3 dalam aquadest, 1:1 dan reagen B ; 10 H 2 SO 4 yang dilanjutkan dengan pemanasan.

b. Pemisahan dengan Kromatografi Kolom

Pemisahan dengan kromatografi kolom dilakukan dilakukan terhadap ekstrak etil asetat M. diclados sebanyak 10 gram dengan menggunakan fase diam silika gel 60 GF 254 sebanyak 150 gram. Adapun kolom kromatografi yang digunakan memiliki ukuran tinggi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 100 cm dan diameter 5 cm. Selanjutnya kolom dipasang pada statif. Pada ujung bagian bawah dalam kolom diberi kapas kemudian dialiri dengan pelarut n-heksana. Kemudian silika gel 60 GF 254 fase diam yang telah ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam gelas beker dan ditambahkan pelarut n-heksana secukupnya lalu diaduk-aduk, selanjutnya dimasukkan ke dalam kolom sedikit demi sedikit, kemudian kolom diketuk-ketuk hingga silika gel 60 GF 254 memadat dan permukaannya rata. Sebanyak 10 gram ekstrak digerus dengan sebagian silika gel 60 GF 254 sebanyak 5 gram sampai terbentuk serbuk lalu dimasukkan ke dalam kolom dan di atas ekstrak ditambahkan kapas untuk menjaga agar permukaan ekstrak tetap rata sehingga pemisahannya baik. Kemudian ditambahkan campuran pelarut sebagai fase gerak yang bertingkat kepolarannya yaitu n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9, 0:10 sebanyak 250 mL ke dalam kolom sedikit demi sedikit sambil kran dibuka, eluat yang keluar dari kolom ditampung dalam vial dan diberi nomor. Dari kromatografi kolom ini dihasilkan 204 fraksi. Yang selanjutnya di uji dengan KLT dan kemudian digabung berdasarkan kesamaan pola kromatogramnya, sehingga diperoleh 9 fraksi gabungan I - IX. Kemudian dilakukan pemurnian lebih lanjut dengan kromatografi kolom. Fraksi yang dilakukan pemurnian lebih lanjut adalah fraksi III dan fraksi IV karena mempunyai pola kromatogram yang menarik. Adapun pelarut yang digunakan adalah n-heksana dan etil asetat dengan berbagai perbandingan.

c. Kromatografi Kolom dari Fraksi III