Tabel 2 Tata cara penyuntikkan antigen
Kelinci Antigen Penyuntikkan Minggu ke-
0 1 3 5 7 1 KP
ES F. gigantica
asal Domba
Tanpa Adjuvant
FAC FAI FAI FAI 2 KH
ES F. gigantica
asal Kerbau
Tanpa Adjuvant
FAC FAI FAI FAI
Keterangan: Tanpa Adjuvant Rute i.v
FAC = Freund’s Adjuvant Complete Rute s.c
FAI = Freund’s Adjuvant Incomplete Rute s.c
KP = Kelinci yang diimunisasi ES F. gigantica asal domba
KH = Kelinci yang diimunisasi ES F. gigantica asal kerbau
3.3.5 Teknik Pengambilan Darah
Darah kelinci diambil sebanyak 1,5-2 ml melalui vena auricularis dengan menggunakan disposable syringe 3 ml IACUC 2010. Pengambilan darah
pertama dilakukan sebelum kelinci diimunisasi. Pengambilan darah kedua dilakukan seminggu setelah pengambilan darah pertama dan pengambilan darah
ketiga dilakukan empat minggu setelah pengambilan darah kedua. Pengambilan darah berikutnya dilakukan setiap seminggu sekali hingga minggu ke-14. Sampel
darah dimasukkan dalam tabung reaksi untuk diambil serumnya.
3.3.6 Teknik Pengumpulan Serum
Darah yang diambil dari kedua kelinci, dikumpulkan dalam tabung terpisah yang dimasukkan ke dalam inkubator dengan suhu 37
o
C dengan posisi miring selama 30 menit. Kemudian disimpan dalam refrigerator semalam pada
suhu 4
o
C. Serum yang didapat dikumpulkan menggunakan pipet mikro. Bila perlu, darah disentrifus dengan kecepatan 2000g selama 15 menit. Serum yang
didapat dipisahkan kemudian dimasukkan ke dalam tabung mikro dan diberi tanggal pengambilan darah serta kode kelinci.
3.3.7 Pembuatan Antigen Terlarut
Antigen dan antibodi harus dapat berdifusi dengan baik dalam uji presipitasi menggunakan media agar. Antibodi dalam serum memiliki ukuran
molekul protein yang kecil sehingga mudah berdifusi sedangkan antigen ES
memiliki molekul protein yang besar sehingga harus dipecah salah satunya dengan menggunakan teknik sonikasi. Teknik sonikasi digunakan dalam
penelitian ini untuk membuat antigen ES Fasciola gigantica menjadi terlarut solubel dalam agar Parimala dan Ishaq 2005. Antigen ES Fasciola gigantica
dimasukkan dalam tabung sonikasi. Tabung sonikasi dimasukkan dalam sonikator yang berisi air bersuhu 4
o
C. Hal ini bertujuan untuk mendinginkan tabung dan mencegah kerusakan antigen karena panas yang ditimbulkan selama proses
berlangsung. Proses sonikasi dilakukan kurang lebih selama tiga menit dengan frekuensi 50.000 Hz.
3.3.8 Teknik Agar Gel Precipitation Test AGPT
Agar Gel Precipitation Test AGPT merupakan uji presipitasi antigen
yang terlarut. Teknik uji presipitasi dalam penelitian ini menggunakan metode Ouchterlony 1953. Bahan untuk AGPT terdiri atas Phosphate Buffer Saline
PBS dengan pH 7,4, aquabides, agarose 1, dan Na acide 0,001. Campuran tersebut dipanaskan dalam microwave atau dengan penangas air sampai agar larut
dan mendidih. Sebanyak 4 ml larutan agar dituang diatas gelas objek hingga seluruh permukaan gelas objek tertutup dengan agar dan dibiarkan hingga
mengeras. Agar yang telah mengeras, dilubangi menggunakan puncher agar. Lubang pada bagian tengah diisi dengan antigen yang telah disonikasi dan enam
lubang disekelilingnya diisi dengan serum antibodi yang akan diuji Boulanger 1967. Agar disimpan di dalam wadah tertutup yang telah dialasi dengan kertas
atau tissue basah untuk menjaga kelembaban dan didiamkan selama 24 hingga 48 jam pada suhu ruang. Pengamatan dapat dilakukan dengan melihat garis
presipitasi yang terbentuk.
` 3.3.9 Pemurnian
Immunoglobulin G Ig G
Serum kelinci positif mengandung antibodi dimurnikan menggunakan metode pemurnian dari Montage
®
Antibody Purification Kit and Spin Columns with PROSEP
®
-A Media . Media PROSEP
®
-A yang digunakan dipre-ekuilibrasi
menggunakan 10 ml Binding Buffer A dengan mensentrifus spin column dengan kecepatan 500g selama 30 menit pada suhu 4
o
C. Sampel berupa serum kelinci anti
