memiliki molekul protein yang besar sehingga harus dipecah salah satunya dengan menggunakan teknik sonikasi. Teknik sonikasi digunakan dalam
penelitian ini untuk membuat antigen ES Fasciola gigantica menjadi terlarut solubel dalam agar Parimala dan Ishaq 2005. Antigen ES Fasciola gigantica
dimasukkan dalam tabung sonikasi. Tabung sonikasi dimasukkan dalam sonikator yang berisi air bersuhu 4
o
C. Hal ini bertujuan untuk mendinginkan tabung dan mencegah kerusakan antigen karena panas yang ditimbulkan selama proses
berlangsung. Proses sonikasi dilakukan kurang lebih selama tiga menit dengan frekuensi 50.000 Hz.
3.3.8 Teknik Agar Gel Precipitation Test AGPT
Agar Gel Precipitation Test AGPT merupakan uji presipitasi antigen
yang terlarut. Teknik uji presipitasi dalam penelitian ini menggunakan metode Ouchterlony 1953. Bahan untuk AGPT terdiri atas Phosphate Buffer Saline
PBS dengan pH 7,4, aquabides, agarose 1, dan Na acide 0,001. Campuran tersebut dipanaskan dalam microwave atau dengan penangas air sampai agar larut
dan mendidih. Sebanyak 4 ml larutan agar dituang diatas gelas objek hingga seluruh permukaan gelas objek tertutup dengan agar dan dibiarkan hingga
mengeras. Agar yang telah mengeras, dilubangi menggunakan puncher agar. Lubang pada bagian tengah diisi dengan antigen yang telah disonikasi dan enam
lubang disekelilingnya diisi dengan serum antibodi yang akan diuji Boulanger 1967. Agar disimpan di dalam wadah tertutup yang telah dialasi dengan kertas
atau tissue basah untuk menjaga kelembaban dan didiamkan selama 24 hingga 48 jam pada suhu ruang. Pengamatan dapat dilakukan dengan melihat garis
presipitasi yang terbentuk.
` 3.3.9 Pemurnian
Immunoglobulin G Ig G
Serum kelinci positif mengandung antibodi dimurnikan menggunakan metode pemurnian dari Montage
®
Antibody Purification Kit and Spin Columns with PROSEP
®
-A Media . Media PROSEP
®
-A yang digunakan dipre-ekuilibrasi
menggunakan 10 ml Binding Buffer A dengan mensentrifus spin column dengan kecepatan 500g selama 30 menit pada suhu 4
o
C. Sampel berupa serum kelinci anti
Fasciola gigantica kerbau dan domba disaring menggunakan 0,2 µm Steriflip-GP
filter . Serum yang telah difiltrasi ditambahkan dengan Binding Buffer A dengan
volume yang sama banyak perbandingan 1:1 vv kemudian disentrifus dengan kecepatan 500g selama 30 menit pada suhu 4
o
C. Supernatan didasar tabung dibuang kemudian spin column dibilas menggunakan 20 ml Binding Buffer A dan
disentrifus dengan kecepatan 500g selama 30 menit pada suhu 4
o
C untuk menghilangkan kontaminan yang tidak terikat. Sepuluh ml Elution Buffer B2
ditambahkan langsung kedalam spin column dalam tabung steril baru yang telah diisi 1,3 ml Neutralization Buffer C kemudian disentrifus dengan kecepatan 4500g
selama 40 menit pada suhu 4
o
C. Supernatan didasar tabung yang mengandung Ig G diambil, kemudian difiltrasi menggunakan Amicon 30.000 dan disentrifus
dengan kecepatan 4500g selama 25 menit pada suhu 4
o
C. Konsentrasi Ig G dihitung menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm dengan
metode Bradford 1976. Supernatan berupa Ig G yang tertinggal didalam filter disimpan dalam tabung-tabung mikro volume 1,5 ml, disimpan dalam suhu -20
o
C. Ig G yang telah dipurifikasi diuji kembali dengan AGPT menggunakan antigen
ES Fasciola gigantica.
