Teknik Agar Gel Precipitation Test AGPT

Fasciola gigantica kerbau dan domba disaring menggunakan 0,2 µm Steriflip-GP filter . Serum yang telah difiltrasi ditambahkan dengan Binding Buffer A dengan volume yang sama banyak perbandingan 1:1 vv kemudian disentrifus dengan kecepatan 500g selama 30 menit pada suhu 4 o C. Supernatan didasar tabung dibuang kemudian spin column dibilas menggunakan 20 ml Binding Buffer A dan disentrifus dengan kecepatan 500g selama 30 menit pada suhu 4 o C untuk menghilangkan kontaminan yang tidak terikat. Sepuluh ml Elution Buffer B2 ditambahkan langsung kedalam spin column dalam tabung steril baru yang telah diisi 1,3 ml Neutralization Buffer C kemudian disentrifus dengan kecepatan 4500g selama 40 menit pada suhu 4 o C. Supernatan didasar tabung yang mengandung Ig G diambil, kemudian difiltrasi menggunakan Amicon 30.000 dan disentrifus dengan kecepatan 4500g selama 25 menit pada suhu 4 o C. Konsentrasi Ig G dihitung menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm dengan metode Bradford 1976. Supernatan berupa Ig G yang tertinggal didalam filter disimpan dalam tabung-tabung mikro volume 1,5 ml, disimpan dalam suhu -20 o C. Ig G yang telah dipurifikasi diuji kembali dengan AGPT menggunakan antigen ES Fasciola gigantica.

4. HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil pemeriksaan konsentrasi antigen ES Fasciola gigantica asal domba dan kerbau masing-masing sebesar 6755 µg ml dan 6420 µgml. Dosis protein antigen untuk dapat menginduksi antibodi pada kelinci adalah 50–1000 µg antigen IACUC 2010. Dengan demikian, dosis yang digunakan dalam penelitian ini 5x 150 µgekor merupakan dosis yang cukup untuk menginduksi antibodi. Berdasarkan pemeriksaan AGPT, kelinci yang diimunisasi dengan antigen ES Fasciola gigantica asal domba sudah menunjukkan adanya pembentukkan antibodi terhadap ES Fasciola gigantica asal domba pada minggu ke-4. Berbeda dengan kelinci yang disuntik antigen ES Fasciola gigantica asal kerbau, antibodi yang terbentuk terhadap ES Fasciola gigantica asal kerbau, baru dapat dideteksi pada minggu ke-12 Tabel 3. Tabel 3 Data hasil AGPT dilihat dari penebalan presipitasi Antigen Hasil AGPT Minggu ke- 1 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ES FG Domba - - + ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ES FG Kerbau - - - - - - - - - - + ++ +++ Keterangan: + = Presipitasi tipis ++ = Presipitasi sedang +++ = Presipitasi tebal  = Tidak terbentuk presipitasi Garis presipitasi yang tebal mulai tampak dari serum yang mengandung antibodi anti ES Fasciola gigantica asal domba pada minggu ke-6. Perbandingan antara garis presipitasi awal yang terbentuk dan penebalan presipitasi antibodi anti ES Fasciola gigantica asal domba,dapat dilihat pada Gambar 2. Serum yang mengandung antibodi anti ES Fasciola gigantica asal kerbau nampak tebal pada minggu ke-14. Perbandingan antara garis presipitasi awal yang terbentuk dan penebalan presipitasi antibodi anti ES Fasciola gigantica asal kerbau, dapat dilihat pada Gambar 3. Namun, deteksi garis presipitasi antibodi anti ES Fasciola gigantica asal kerbau yang terbentuk tidak setebal presipitasi antibodi anti ES Fasciola gigantica asal domba. Gambar 2 Hasil AGPT; a presipitasi antibodi anti ES Fasciola gigantica asal domba KP pada minggu ke-4 dengan antigen ES Fasciola gigantica asal domba ditengah sumur; b presipitasi antibodi anti ES Fasciola gigantica asal domba KP pada minggu ke-6 dengan antigen ES Fasciola gigantica asal domba ditengah sumur. Gambar 3 Hasil AGPT; a presipitasi antibodi anti ES Fasciola gigantica asal kerbau KH pada minggu ke-12 dengan antigen ES Fasciola gigantica asal kerbau ditengah sumur terbentuk samar; b presipitasi antibodi anti ES Fasciola gigantica asal kerbau KH pada minggu ke-14 dengan antigen ES Fasciola gigantica asal kerbau ditengah sumur. Pemeriksaan terhadap adanya antibodi anti ES Fasciola gigantica pada masing-masing kelinci setelah dua kali penyuntikkan yaitu penyuntikkan pertama minggu ke-0 maupun kedua minggu ke-1 belum menunjukkan adanya presipitasi. Hal tersebut dapat disebabkan oleh rendahnya antibodi yang terbentuk atau antibodi belum dibentuk pada saat itu. Pengujian keberadaan antibodi dengan uji AGPT memerlukan konsentrasi yang cukup tinggi. Antibodi minimal dalam serum yang dapat dideteksi oleh uji AGPT yaitu 30 µgml Tizzard 2004. Ag. ES FG Domba Ag ES FG Kerbau Ag ES FG Kerbau Ag. ES FG Domba KP 4 KP 4 KP 4 KH 4 KH 4 KP 3 KP 2 KP 1 KH 4 KH 2 KH 3 KH 1 a b KH 5 KH 5 KH 5 KH 5 KH 5 KH 5 KH 6 KH 6 KH 6 KH 6 KH 6 KH 6 a b