22
BAB III METODE PENELITIAN
Metode penelitian ini meliputi penyiapan daun sembukan, identifikasi daun sembukan, pembuatan simplisia, pemeriksaan karakterisasi simplisia, pemeriksaan
skrining fitokimia, pembuatan ekstrak etanol daun sembukan dengan cara maserasi, penyiapan hewan percobaan dan pengujian efek antiinflamasi dengan
metode paw edem. Data hasil penelitian dianalisis dengan one way ANOVA Analysis of Variance dan dilanjutkan dengan uji Duncan untuk melihat
perbedaan nyata antar peelakuan menggunakan program SPSS Statistic Product and Service Solution versi 17.0. Penelitian dilkukan di Laboratorium
Farmakognosi dan Laboratorium Farmakologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
3.1 Alat-alat dan Bahan 3.1.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi lemari pengering, blender Panasonic, oven Dynamica, pletismometer Ugo Basile cat No. 7140,
neraca listrik Vibra AJ, neraca hewan GW-1500, mikroskop Olympus, incubator Gallenkamp, penangas air, rotary evaporator Stuart, spuit, oral sonde,
mortir dan stamfer dan alat-alat gelas,
3.1.2Bahan-bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah simplisia daun sembukan dan ekstrak etanol daun sembukan Paederia foetida L, natrium
Universitas Sumatera Utara
23 diklofenak, karboksilmetilsellulosa Na-CMC,
λ-karagenan, larutan fisiologis NaCl 0,9, air suling, etanol 96.
3.2 Penyiapan Sampel 3.2.1 Pengumpulansampel
Pengumpulan daun sembukandilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Daun sembukan
yang digunakan adalah daun sembukan yang masih segar.Daun sembukan diambil dari Dusun Cinta Makmur, Kecamatan Bilah Hulu, Kabupaten Labuhan Batu,
Sumatera Utara.
3.2.2 Identifikasi sampel
Identifikasi daun sembukan dilakukan Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor. Tumbuhan yang diidentifikasi adalah
bagian daunnya. Hasil identifikasi dapat dilihat pada Lampiran 1 halaman 49. 3.2.3 Pembuatan simplisia daun sembukan
Tumbuhan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun sembukanyang masih segar. Daun sembukan yang telah dikumpulkan dibersihkan dari pengotor,
lalu dicuci dibawah air mengalir hingga bersih kemudian ditiriskan dan ditimbang. Daun sembukan dikeringkan di lemari pengering sampai daun kering ditandai bila
diremas rapuh.Simplisia yang telah kering diblender menjadi serbuk, lalu ditimbang beratnya dan di simpan dalam wadah tertutup.
3.2.4 Pembuatan ekstrak etanol daun sembukan EEDS
Pembuatan ekstrak dilakukan secara maserasi dengan menggunakan pelarut etanol 96.
Universitas Sumatera Utara
24 Menurut Farmakope Indonesia edisi III, 1979 caranya adalah sebagai berikut:
Sebanyak 10 bagian 500g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam sebuah bejana, dituangi dengan 75 bagian 3,75 liter cairan penyari etanol 96, ditutup,
dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sesekali diaduk, kemudian diserkai, diperas. Ampas diremaserasi dengan cairan penyari etanol 96
secukupnya hingga diperoleh 5 liter 100 bagian. Pindahkan ke bejana tertutup, dibiarkan ditempat sejuk, terlindung dari cahaya selama 2 hari. Enap tuangkan atau
saring. Pemekatan ekstrak dilakukan dengan alat rotary evaporatorpada suhu 40
C. Bagan alur pembuatan ekstrak etanol daun sembukan dapat dilihat pada Lampiran 8 halaman 59.
3.3Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia Daun Sembukan
Pemeriksaan karakterisasi simplisia meliputi makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari larut air, penetapan kadar sari larut
etanol, penetapan kadar abu total dan penetapan kadar abu tidak larut asam.
3.3.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, ukuran, diameter dan organoleptis dari daun sembukan segar dan simplisia daun
sembukan.
3.3.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap daun sembukan segar dan serbuk simplisia daun sembukan. Daun sembukan dipotong melintang lalu
diletakkan di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, selanjutnya diamati di bawah mikroskop.
Universitas Sumatera Utara
25 Pemeriksaan mikroskopik pada serbuk simplisia daun sembukan ditaburkan di atas
kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop. Gambar mikroskopik dapat
dilihat pada Lampiran 5 halaman 53.
3.3.3 Penetapan kadar air
Alat terdiri dari labu alas bulat 500 mL, pendingin, tabung penyambung, tabung penerima 5 mL berskala 0,05 mL, alat penampung dan pemanas listrik.
Cara kerja : 1.
Penjenuhan toluen Sebanyak 200 mL toluen dan 2 mL air suling dimasukkan ke dalam labu alas
bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2 jam. Toluen dibiarkanmendingin selama 30 menit dan dibaca volum air pada tabung
penerima dengan ketelitin 0,05 mL WHO, 1998. 2.
Penetapan kadar air simplisia Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama dimasukkan ke
dalam labu yang berisi toluen yang telah dijenuhkan, kemudian labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit.Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes
tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan tetesan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik.Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam
pendingin dibilas dengan toluen.Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluena
memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 mL. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan
Universitas Sumatera Utara
26 yang diperiksa.Kadar air dihitung dalam persenWHO, 1998. Perhitungan kadar
air dapat dilihat pada Lampiran 6 halaman 54.
3.3.4 Penetapan kadar sari larut dalam air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 mL air- klorofom 2,5 mL klorofom dalam air suling sampai 1 liter dan labu bersumbat
dikocok sesekali sampai 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Sejumlah 20 mL filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam
cawan peguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105
C sampai bobot tetap. Kadar sari larut etanol dihitung dalam persen Depkes, RI., 2000. Perhitungan kadar sari larut dalam air dapat
dilihat pada Lampiran 6 halaman 54.
3.3.5 Penetapan kadar sari larut etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 mL etanol 96 dan labu bersumbat dikocok sesekali sampai 6 jam pertama, kemudian
dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Sejumlah 20 mL filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan peguap yang berdasar rata yang telah
dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 C sampai bobot tetap.
Kadar sari larut etanol dihitung dalam persen Depkes RI, 2000. Perhitungan kadar sari larut etanol dapat dilihat pada Lampiran 6 halaman 55.
3.3.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang dimasukkan ke dalam kurs porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Kurs dipijar
perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan pada suhu 600 C selama
3 jam, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar
Universitas Sumatera Utara
27 abu total dihitung dalam persen Depkes, RI., 2000. Perhitungan kadar abu total
dapat dilihat pada Lampiran 6 halaman 56.
3.3.7 Penetapan kadar abu tidak larut dalam asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu didihkan dalam 25 mL asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu lalu dipijar sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang . Kadar abu yang tidak larut dalam
asam dihitung dalam bentuk persen Depkes, RI., 2000. Perhitungan kadar abu tidak larut asam dapat dilihat pada Lampiran 6 halaman 57.
3.4 Skrining Fitokimia
3.4.1 Pemeriksaan alkaloida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 mL asam klorida 2 N dan 9 mL air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2
menit, didinginkan lalu disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut:
a. filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Mayer akan
terbentuk endapan berwarna putih atau kuning. b.
filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Bouchardat akan terbentuk endapan berwarna coklat-hitam.
c. filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan pereksi Dragendorff akan
terbentuk endapan berwarna merah atau jingga. Alkaloida dinyatakan positif jika terjadi endapan atau paling sedikit dua
atau tiga dari percobaan di atas Depkes, RI., 1995.
Universitas Sumatera Utara
28
3.4.2 Pemeriksaan flavonoida
Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambahkan 10 mL air suling, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keaadaan panas. Filtrat yang diperoleh diambil
5 mL, ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium, 1 mL asam klorida pekat dan 2 mL amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna
merah kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1996
3.4.3 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g sampel disari dengan 10 mL air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 mL
larutan lalu ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida. Terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth, 1996.
3.4.4 Pemeriksaan glikosida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 g kemudian disari dengan 30 mL campuran 7 bagian volume etanol 96 dan 3 bagian volume air suling, selanjutnya
ditambahkan 10 mL HCl 2 N, direfluks selama 10 menit, didinginkan dan disaring. Pada 30 mL filtrat ditambahkan 25 mL air suling dan 25 mL timbal II asetat 0,4
M, dikocok, didiamkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat disari sebanyak 3 kali, tiap kali dengan 20 mL campuran 3 bagian volume kloroform dan 2 bagian volume
isopropanol. Diambil lapisan air kemudian ditambahkan 2 mL air dan 5 tetes pereaksi Molisch, ditambahkan hati-hati 2 mL asam sulfat pekat terbentuk cincin
warna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya ikatan gula Depkes, RI., 1995.
Universitas Sumatera Utara
29
3.4.5 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 mL air suling panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik,
timbul busa yang mantap tidak kurang dari 10 menit setinggi 1-10 cm. Ditambahkan 1 tetes larutan asam klorida 2 N, bila buih tidak hilang menunjukkan
adanya saponin Depkes, RI., 1995.
3.4.6 Pemeriksaan steroidatriterpenoida
Sebanyak 1 g sampel dimaserasi dengan 20 mLn-heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa dalam cawan penguap
ditambahkan 2 tetes asam asetat glasial dan 1 tetes asam sulfat pekat. Timbulnya warna biru atau biru hijau menunjukkan adanya steroid, sedangkan warna merah,
merah muda atau ungu menunjukkan adanya triterpenoidHarborne, 1987.
3.5 Uji Efek Antiinflamasi
Pengujian efek antiinflamasi ini terdiri dari beberapa tahap, yaitu penyiapan hewan percobaan, penyiapan bahan, dan pengujian efek antiinflamasi.
3.5.1 Pembuatan suspensi Na CMC 0,5
Sebanyak 500 mg Na CMC ditaburkan kedalam lumpang berisi air suling panas sebanyak 10 mL, ditutup dan dibiarkan selama 15 menit, kemudian digerus
hingga diperoleh massa yang transparan, lalu diencekan dengan air suling dimasukkan ke dalam labu tentukur dicukupkan hingga 100 mL Anief, 1995.
Universitas Sumatera Utara
30
3.5.2 Pembuatan suspensi natrium diklofenak dosis 4,5 mgkg bb
Sebanyak 4,5 mg serbuk natrium diklofenak digerus, kemudian ditambahkan sedikit suspensi Na-CMC 0,5 digerus sampai homogen, dimasukkan ke dalam
labu tentukur 10 mL, dicukupkan sampai garis tanda dengan suspensi Na-CMC 0,5.
3.5.3 Pembuatan suspensi ekstrak etanol daun sembukan EEDS dosis 300 mgkg bb, 400 mgkg bb dan 500 mgkg bb
Ditimbang masing-masing 300 mgkg bb, 400 mgkg bb dan 500 mgkg bb ekstrak etanol daun sembukan, kemudian dimasukkan ke dalam lumpang
ditambahkan sedikit suspensi Na-CMC digerus sampai homogen. Dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 mL, dicukupkan sampai garis tanda. Perhitungan dosis
ekstrak etanol daun sembukan dapat dilihat pada lampiran 13 halaman 64.
3.5.4 Pembuatan larutan λ-karagenan 1
Ditimbang sebanyak 100 mg λ-karagenan, digerus sampai homogen dengan
larutan NaCl 0,9, kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 mL, dicukupkan dengan larutan NaCl 0,9 sampai garis tanda. Diinkubasi pada suhu
37 C selama 24 jam Linnon, 2009.
3.5.5Pembuatan larutan reservoir
Sebanyak 2 mL campuran senyawa pembasah Ornano Imbente BBC. 97 yang telah tersedia dalam kemasan standar dimasukkan ke dalam labu tentukur 1
L, ditambahkan 0,4 NaCl kemudian dilarutkan dengan air suling lalu dimasukkan ke dalam labu tentukur 1 L , kemudian dicukupkan sampai garis tanda
Linnon,2009.
Universitas Sumatera Utara
31
3.5.6Penyiapan hewan percobaan
Hewan yang digunakan pada penelitian ini adalah tikus putih jantan yang sehat sebanyak 25 ekor dengan berat badan 150-200 g. Sebelum pengujian terlebih
dahulu tikus dikondisikan selama 1 minggu dalam kandang yang baik untuk menyesuaikan diri dengan lingkungannya. Hewan yang digunakan pada penelitian
ini telah disetujui penggunaanya oleh Ketua Komite Etik Penelitian Hewan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam-Universitas Sumatera Utara
Animal Research Ethics Commitees EREC. Rekomendasi persetujuan dapat dilihat pada Lampiran 2 halaman 50.
3.5.7 Pengujian efek antiinflamasi
Sebelum pengujian tikus dipuasakan selama 18 jam tidak makan tetapi masih tetap diberi minum. Hewan dikelompokkan kedalam 5 kelompok, yang
masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor tikus, yaitu kelompok kontrol negatif suspensi Na-CMC, kelompok kontrol positif Natrium diklofenak, kelompok
bahan uji ekstrak etanol daun sembukan dosis 300, 400 dan 500 mgkg bb. Pada hari pengujian masing-masing tikus diberi tanda pada bagian ekor dan
pada kaki kanan tikus lalu hewan ditimbang beratnya. Kemudian kaki kanan tikus dimasukkan ke dalam sel yang berisi cairan khusus yang ada pada alat
pletismometer sampai cairan naik pada garis batas atas, kemudian pedal ditahan, dicatat angka pada monitor sebagai volume awal Vo yaitu volume kaki sebelum
diberi obat dan diinduksi larutan λ- karagenan. Setelah itu masing-masing tikus
diberi suspensi bahan uji secara oral sesuai dengan kelompoknya. Satu jam kemudian, masing-masing telapak kaki tikus disuntik secara intraplantar dengan
0,1 mL larutan λ -karagenan 1. Setelah 30 menit, dilakukan pengukuran dengan
Universitas Sumatera Utara
32 cara mencelupkan kaki tikus pada sel pletismometer yang berisi cairan khusus
sampai larutan mencapai garis batas atas, dan pedal dithan. Dicatat angkapada monitor. Perubahan volume cairan yang terjadi dicatat sebagai volume telapak
kaki tikus Vt. Pengukuran dilakukan setiap 30 menit selama 360 menit. Dan tiap kali pengukuran larutan sel tetap dicukupkan sampai garis tanda atau garis merah
bagian atas sel dan pada menu utama ditekan tombol nol dan juga kaki tikus dikeringkan sebelumnya Parmar dan Prakash, 2006.
Volume radang adalah selisih volume telapak kaki tikus setelah dan sebelum disuntikkan
λ-karagenan. Pada waktu pengukuran, volume cairan pada sel pletismometer sama setiap kali pengukuran dan tanda batas pada kaki tikus harus
jelas, kaki tikus harus tercelup sampai batas yang dibuat Juheini, dkk., 1990. Bagan kerja uji antiinflamasi dapat dilihat pada Lampiran 9 halaman 60.
3.6 Rumus Perhitungan Persentase Radang R dan Persentase Inhibisi
Radang IR
3.6.1 Persen radang R
� = �� − ��
�� � 100
Keterangan: Vo = volume mula-mula
Vt = volume udem kaki pada waktu t 3.6.2 Persentase inhibisi radang IR
�� = � − �
� � 100
Keterangan:
a = volume udem pada kelompok hewan kontrol b = volume udem pada kelompok hewan uji Mansjoer, 1997.
Universitas Sumatera Utara
33 Contoh perhitungan persentase radang dapat dilihat pada Lampiran 16 halaman 69
dan persentase inhibisi radang dapat dilihat pada Lampiran 17 halaman 71.
3.7 Analisis Data
Data hasil penelitian dianalisis secara ststistik menggunakan analisis variansi ANOVA dengan program SPSS dengan tingkat kepercayaan 95
dilanjutkan dengan uji Duncan untuk mengetahui kelompok mana yang mempunyai pengaruh sama atau berbeda satu dengan yang lainnya.
Universitas Sumatera Utara
34
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Identifikasi Tumbuhan
Hasil identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi-LIPI, menyebutkan bahwa tanaman yang
digunakan adalah tanaman daun sembukan Paederia foetida L, famili Rubiaceae. hasil identifikasi dapat dilihat pada Lampiran 1 halaman 49.
4.2 Hasil Karakteristik Simplisia 4.2.1 Hasil pemeriksaan makroskopik
Hasil pemeriksaan makroskopik dari daun sembukan segar menunjukkan bahwa daun sembukan memmiliki warna hijau, berbau kentut bila di remas,
panjang 9-12 cm, lebar 3-4 cm. Pemeriksaan makroskopik serbuk simplisia daun sembukan dilakukan dengan melihat organoleptis simplisia berupa pemeriksaan
terhadap bau, rasa, warna dari serbuk simplisia daun sembukan. Hasil pemeriksaan menunjukkan bahwa simplisia daun sembukan berwarna coklat kehitaman, rasa
pahit dan berbau khas.
4.2.2 Hasil pemeriksaan mikroskopik
Hasil pemeriksaan mikroskopik dari daun segar dan serbuk simplisia daun sembukan dijumpai adanya stomata tipe parasitik, rambut penutup bentuk bintang
dan kristal kalsium oksalat bentuk jarum. Pengamatan dari daun segar dan serbuk simplisia daun sembukan menggunakan mikroskop dapat dilihat pada Lampiran 5
halaman 53.
Universitas Sumatera Utara
Kategori