Waktu dan Tempat Penelitian Alat Bahan-bahan Identifikasi Alginat Farmakope Indonesia Edisi IV, 1995 Karakterisasi dengan Spektrofotometri Ultraviolet

16

BAB III METODE PENELITIAN

Penelitian ini dilakukan denganmetode eksperimental.Tahapan penelitian meliputi pengumpulan dan pengolahan, skrining fitokimia, pemeriksaan karakteristik simplisia,isolasi alginat dan karateristik alginat yaitu penetapan viskositas, penetapan kadar abu, penetapan susut pengeringan, analisis senyawa alginat secara spektrofotometri ultravioletdan spektrofotometri FTIR.

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan Januari 2016 di Laboratorium Farmakognosi dan Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.

3.2 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas laboratorium, aluminium foil, alat tanurNebertherm, blender Philips,lemari pengering, neraca analitik Mettler Toledo, neraca kasar Ohanus, oven Memmert, termometer, penangas air, cawan porselin berdasar rata, krus porselin bertutup, desikator, spatula, labu bersumbat, botol timbang dangkal bertutup, pH indikator universal, spektrofotometerUV dan FTIR Shimadzu.

3.3 Bahan-bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah talus rumput laut coklat Sargassum ilicifolium C. Agardyang telah diisolasi fukoidannya danbahan Universitas Sumatera Utara 17 kimia lainnya adalah HCl 5, Na karbonat 5, CaCl 2 1, isopropanol 95, α- naftol, amil alkohol, asam nitrat pekat, asam asetat anhidrat, asam klorida pekat, asam sulfat pekat, benzena, besi III klorida, bismuth nitrat, etilasetat, iodium, isopropanol, kalium iodida, kloroform, metanol, natrium hidroksida, natrium klorida, n-heksana, raksa II klorida, serbuk magnesium, timbal II asetat, kloralhidratdan toluena. 3.4 Pembuatan Larutan Pereaksi 3.4.1 Larutan asam klorida 5 Diencerkan 13,51 ml asam klorida pro analis dicampurkan dengan akuades dan dicukupkan hingga 100 ml.

3.4.2 Larutan natrium karbonat 5

Sebanyak 5 gram Na karbonat dilarutkan dalam 100 ml akuades.

3.4.3 Larutan kalsium klorida 1

Sebanyak 1 gram kalsium klorida dilarutkan dalam 100 ml akuades.

3.4.4 Pereaksi Meyer

Sebanyak 2,266 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml dan pada wadah lain dilarutkan 50 g kalium iodida dalam 100 ml air suling. 60 ml larutan I dicampurkan dengan 10 ml larutan II dan ditambahkan air suling hingga 100 ml Ditjen POM RI, 1995.

3.4.5 Pereaksi natrium hidroksida 2 N

Sebanyak 8,002 g natrium hidroksida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Ditjen POM RI, 1979.

3.4.6 Pereaksi Dragendorff

Pereaksi dibuat dua larutan persediaan: 1 0,6 g bismuth nitrat dalam 2 ml Universitas Sumatera Utara 18 HCl pekat dan 10 ml air; 2 6 g kalium iodida dalam 10 ml air. Larutan persediaan ini dicampur dengan 7 ml HCl pekat dan 15 ml air Harborne, 1987.

3.4.7 Pereaksi besi III klorida 1

Sebanyak 1 g besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml, lalu disaring Ditjen POM RI, 1979. 3.4.8 Pereaksi asam klorida 2 N Asam klorida pekat sebanyak 16,6 ml ditambahkan air suling sampai 100 ml Ditjen POM RI, 1979.

3.4.9 Pereaksi Bouchardat

Sebanyak 4 g kalium iodida ditimbang kemudian dilarutkan dalam air suling secukupnya sampai KI larut dengan sempurna, lalu ditambahkan 2 g iodium sedikit demi sedikit.Setelah semuanya larut, dicukupkan dengan air suling hingga volume 100 ml Ditjen POM RI, 1995.

3.4.10 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M

Sebanyak 15,17 g timbal asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbon dioksida hingga 100 ml Ditjen POM RI, 1995.

3.4.11 Pereaksi Liebermann-Burchard

Campurkan 5 ml asam sulfat pekat dengan 50 ml etanol. Tambahkan hati-hati 5 ml asam asetat anhidrida ke dalam campuran tersebut dan dinginkan Ditjen POM RI, 1995.

3.4.12 Pereaksi Molisch

Sebanyak 3 g alfa naftol P dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N secukupnya hingga diperoleh larutan 100 ml Ditjen POM RI, 1995.

3.4.13 Pereaksi kloralhidrat

Pereaksi kloralhidrat dibuat dengan melarutkan kloralhidrat sebanyak 50 g Universitas Sumatera Utara 19 dalam 20 ml air Ditjen POM RI, 1995.

3.4.14 Larutan asam sulfat 2 N

Larutan asam sulfat pekat sebanyak 9,8 ml ditambahkan air suling sampai 100 ml Ditjen POM RI, 1995. 3.5 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan Tumbuhan 3.5.1 Pengumpulan bahan tumbuhan Pengumpulan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif, yaitu tanpa membandingkan dengan daerah yang lain. Umur tumbuhan yang diambil tidak diperhitungkan. Tumbuhan yang digunakan adalah talus rumput laut coklat Sargassum ilicifolium Turner C. Agard yang diambil dari perairan pantai Poncan, Kota Madya Sibolga, Provinsi Sumatera Utara yang telah diisolasi fukoidannya Harni, 2016.

3.5.2 Identifikasi tumbuhan

Identifikasi bahan tumbuhan dilakukan oleh Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI dan Pusat Penelitian Oseanografi di Jakarta. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa tumbuhan yang digunakan adalah rumput laut coklat Sargassum ilicifolium Turner C. Agard. Hasil identifikasi dapat dilihat pada Lampiran 1 halaman41.

3.5.3 Pembuatan simplisia

Talus rumput laut coklat Sargassum ilicifolium Turner C. Agard dibersihkan dari kotoran dan sisa-sisa karang yang melekat lalu dicuci dengan air mengalir sampai bersih, ditiriskan dan disebar di atas kertas agar airnya terserap, lalu ditimbang berat basah 26 kg. Selanjutnya dikeringkan dengan cara diangin- angin di udara dan dikeringkan di lemari pengering pada suhu 40-50 C hingga Universitas Sumatera Utara 20 rapuh bisa dipatahkan, kemudian disortasi kering dan diperoleh berat 2,5 kg, lalu dihaluskan sampai menjadi serbuk. Gambar serbuk simplisia dapat dilihat pada Lampiran 3 halaman43. 3.6Pemeriksaan Karakteristik Simplisia 3.6.1 Pemeriksaan makroskopik Pemeriksaan maskroskopik simplisia meliputi pengamatan terhadap bentuk talus, bentuk percabangan dan warna talus simplisia rumput lautcoklat Sargassum ilicifolium Turner C. Agard. Gambar makroskopik talus rumput laut coklat Sargassum ilicifolium Turner C. Agarddapat dilihat pada Lampiran 2 halaman42. 3.6.2 Pemeriksaan mikroskopik Pemeriksaan mikroskopik simplisia dilakukan terhadap serbuk simplisia talus rumput laut coklat Sargassum ilicifolium Turner C. Agardyang dikeringkan. Serbuk simplisia ditaburkan di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan koralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup kemudian diamati di bawah mikroskop. Gambar mikroskopik simplisia talus rumput laut coklat Sargassum ilicifolium Turner C. Agard dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman44.

3.6.3 Penetapan kadar air

a. Penjenuhan toluen Toluen sebanyak 200 ml dimasukkan ke dalam labu alas bulat, lalu ditambahkan 2 ml air suling, kemudian alat untuk penetapan kadar air dipasang dan dilakukan destilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama ± 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dan dengan ketelitian 0,1 ml. Universitas Sumatera Utara 21 b. Penetapan kadar air simplisia Labu berisi toluene tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, dipanaskan hati-hati selama 15 menit, setelah toluen mendidih, kecepatan toluen diatur 2 tetes per detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes per detik dan setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,1 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kadar air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1992.Perhitungan kadar air dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman45.

3.6.4 Penetapan kadar sari larut dalam air

Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam aquadest sampai 1 L dengan menggunakan botol bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sebanyak 20 ml filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Residu dipanaskan dalam oven pada suhu 105 o C sampai diperoleh bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.Perhitungan kadar sari larut air dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman 45.

3.6.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol

Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dengan menggunakan botol bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam dan disaring. Sebanyak Universitas Sumatera Utara 22 20 ml filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Residu dipanaskan dalam oven pada suhu 105 o C sampai diperoleh bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.Perhitungan kadar sari larut etanol dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman46.

3.6.6 Penetapan kadar abu total

Sebanyak 2,5 g serbuk simplisia yang telah digerus dan ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus porselin bersama isinya dipijarkan perlahan hingga arang habis, didinginkan, ditimbang sampai diperoleh bobot yang tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995.Perhitungan kadar abu total dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman46.

3.6.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut asam

Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu total dididihkan dengan 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut asam dikumpulkan, disaring dengan kertas saring, lalu cuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijarkan sampai diperoleh bobot yang tetap, dinginkan, dan ditimbang beratnya. Kadar abu yang tidak larut asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995.Perhitungan kadar air dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman47.

3.7 Skrining Fitokimia

Skrining fitokimia dari serbuk simplisiarumput lautcoklat Sargassum ilicifolium Turner C. Agardmeliputi pemeriksaan golongan senyawa alkaloida, flavonoida, saponin, tanin, glikosidadan steroidatriterpenoida Depkes RI, 1995. Universitas Sumatera Utara 23

3.7.1 Pemeriksaan alkaloid

klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanasakan di atas penangas air selama 2 menit. Didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan sebagai berikut : a. Filtrat sebayak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Meyer, akan terbentuk endapan menggumpal bewarna putih atau kuning. b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam. c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Dragendorff, akan terbentuk endapan merah atau jingga. Serbuk mengandung alkaloida jika sekurang-kurangnya terbentuk endapan menggunakan dua golongan larutan percobaan Depkes RI, 1995.

3.7.2 Pemeriksaan flavonoid

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditambahkan 20 ml air panas, dididihkan selama 10 menit dan disaring dalam keadaan panas, kemudian ke dalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan campuran memisah. Flavonoida dikatakan positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.

3.7.3 Pemeriksaan saponin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia rumput lautcoklat Sargassum ilicifolium Turner C. Agard dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok selama 10 detik, jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya senyawa saponin Depkes RI, 1995. Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam Universitas Sumatera Utara 24

3.7.4 Pemeriksaan tanin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida 1 . Jika terjadi warna hijau, biru atau kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth, 1966. 3.7.5 Pemeriksaan glikosida Sebanyak 3 g serbuk simplisia disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air suling 7:3, ditambahkan asam sulfat pekat hingga diperoleh pH 2, kemudian direfluks selama 10 menit, didinginkan dan disaring. Sebanyak 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Kumpulan sari air diuapkan dengan temperatur tidak lebih dari 50 o C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa dipakai untuk percobaan berikut: a. Larutan sisa dimasukkan ke dalam tabung reaksi selanjutnya diuapkan di atas penangas air, pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish. Tambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan, menunjukkan adanya ikatan gula. b. Larutan percobaan diuapkan di atas penangas air. Larutkan sisa dalam 5 ml asam asetat anhidrat. Tambahkan 10 tetes asam sulfat pekat akan terjadi warna biru atau hijau menunjukkan adanya glikosida Depkes RI, 1995.

3.7.6 Pemeriksaan triterpenoidsteroid

Sebanyak 1 g sampel dimaserasi dengan n-heksana selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan 2 tetes Universitas Sumatera Utara 25 asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat. Timbul warna biru atau hijau menunjukkan adanya steroid dan timbul warna merah, pink atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid Farnsworth, 1966.

3.8 Isolasi alginat

Proses isolasi alginat dibagi dalam tiga tahap, yaitu tahap praekstraksi,isolasi dan pembuatan natrium alginatRimelda, 2012.

3.8.1 Tahap praekstraksi

Sebanyak 100 g serbuk kering Sargassum ilicifolium Turner C. Agard yang telah diisolasi fukoidannya direndam dengan larutan asam klorida 5 selama 2 jam kemudian disaring, lalu ampas dicuci dengan air suling sampai netral.

3.8.2 Tahap ekstraksi

Ampas yang telah dicuci selanjutnya diekstraksi menggunakan larutan natrium karbonat 5 dengan pemanasan 50-60 C selama 2 jam, selanjutnya disaring. Larutan natrium alginat yang diperoleh ditambahkan dengan kalsium klorida 1 sehingga terbentuk kalsium alginat dalam bentuk gel. Kalsium alginat yang diperoleh diubah menjadi asam alginat dengan menambahkan larutan asam klorida 5 sedikit demi sedikit sampai pH 3. Asam alginat yang berbentuk gel selanjutnya disaring dan dicuci dengan air suling sampai netral.

3.8.3 Tahap pembuatan natrium alginat

Asam alginat yang berbentuk gel dilarutkan dalam larutan natrium karbonat 5 sampai pH 8-9 sehingga terbentuk natrium alginat. Natrium alginat yang terbentuk diendapkan dengan isopropanol 95. Natrium alginat yang diperoleh dikeringkandi oven pada suhu 50 o C lalu dihaluskan di dalam lumping Universitas Sumatera Utara 26 dan kemudian ditimbang. Bagan isolasi dan karakterisasi natrium alginat dapat dilihat pada Lampiran 6halaman48. Rendemen dari natrium alginat dapat dilihat pada Lampiran7 halaman49 dan warna natrium alginat dapat dilihat pada Lampiran8 halaman50.

3.9 Identifikasi Alginat Farmakope Indonesia Edisi IV, 1995

1. Pada 5 ml larutan dalam natrium hidroksida 0,1N, ditambahkan 1 ml kalsium klorida terbentuk endapan ruah berupa jeli. 2. Pada 5 ml larutan dalam natrium hidroksida 0,1 N, ditambahkan 1 ml asam sulfat 4N terbentuk endapan berat berupa jeli.

3.10 Pemeriksaan Karakterisasi Natrium Alginat

Karakterisasi natrium alginat meliputi cara fisika dan fisikokimia. Pemeriksaan fisika meliputi penetapan viskositas, penetapan kadar abu dan penetapan susut pengeringan. Pemeriksaan fisikokimia meliputi analisis spektrofotometri inframerah dan spektrofotometri ultraviolet.

3.10.1 Penetapanviskositas

Viskositas natrium alginat diukur dengan menggunakan viskosimeter Brookfield Brookfield Engineering Laboratories, yaitu dengan cara: beaker glass berisi sampel diletakkan di bawah tempat spindel, dipasang spindel sesuai nomor, lalu spindel diturunkan hingga permukaan cairan mencapai batas spindle. Diatur kecepatan, kemudian tekan tombol ON untuk menghidupkan. Lihat dengan teliti jarum yang bergerak pada skala hingga jarum stabil pada skala tertentu, viskositas ditentukan dengan: viskositas = faktor koreksi x skala terbaca. Pengukuran viskositas dilakukan pada konsentrasi natrium alginat 1 bv dalam Universitas Sumatera Utara 27 air suling dan dinyatakan dengan sentipois cps.Conttrell dan Konvacs, 1980.Perlakuan diulang 3 kali triplo.Perhitungannya dapat dilihat pada Lampiran 9 halaman 51.

3.10.2 Penetapan kadarabu total

Penetapan kadar abu total dilakukan sama seperti penetapan kadar abu simplisia Materia Medika Indonesia, 1989;; WHO, 1992. Hasil penetapan kadar abu dapat dilihat pada Lampiran 9halaman51. 3.10.3Penetapan kadarabu tidak larut asam Penetapan kadar abu tidak larut asam dilakukan sama seperti penetapan kadar abu tidak larut asam simplisia Materia Medika Indonesia, 1989; WHO, 1992. Hasil penetapan kadar abu dapat dilihat pada Lampiran 9 halaman51.

3.10.4 Penetapan susut pengeringan

Susut pengeringan adalah kadar bagian yang menguap dari suatu zat. Sebanyak 1 g serbuk kering ditimbang seksama dalam cawan dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105 C selama 30 menit. Zat diratakan dalam cawan hingga merupakan lapisan setebal 5-10 mm, dimasukkan ke dalam ruang pengering, dibuka tutupnya lalu dikeringkan pada suhu 105 C selama 5 jam hingga bobot tetap. Susut pengeringan dihitung terhadap bahan awal Materia Medika Indonesia, 1989; WHO, 1992. Hasil penetapan susut pengeringan dapat dilihat pada Lampiran9 halaman 52.

3.11 Karakterisasi dengan Spektrofotometri Ultraviolet

Ditimbang 20 mg serbuk natrium alginat, dilarutkan dengan asam klorida 0,1N dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml, lalu dicukupkan hingga garis Universitas Sumatera Utara 28 tanda. Diukur pada serapan 0,2-0,6. Kemudian dibandingkan dengan senyawa natrium alginat baku. 3.12Karakterisasi dengan Spektrofotometri Inframerah Serbuk natrium alginat dicampur dengan KBr dan digerus di dalam lumpang kemudian ditekan hingga diperoleh pelet kemudian dimasukkan ke dalam alat spektrofotometer FTIR, diukur serapannya pada bilangan gelombang 4000-400 cm -1 . Kemudian dibandingkan dengan spektrum senyawa natrium alginat baku. Universitas Sumatera Utara 29

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Identifikasi Tanaman

Identifikasi tumbuhan dilakukan oleh Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI dan Pusat Penelitian Oseanografi di Jakarta.Hasil dari identifikasi tersebut adalah talus rumput laut coklat Sargassum ilicifoliumTurner C. Agard, divisi Phaeophyta, kelas Phaeophyceae, bangsa Fucales, suku Sargassaceae dan marga Sargassum. 4.2 Hasil Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia 4.2.1 Pemeriksaan makroskopik Hasil pemeriksaan makroskopik rumput laut coklat Sargassum illicifolium Turner C. Agard adalah berbentuk talus, berwarna coklat kehitaman, berbau khas dan tidak berasa.

4.2.2 Pemeriksaan mikroskopik

Hasil pemeriksaan mikroskopik serbuk simplisia rumput laut coklat Sargassum illicifolium Turner C. Agardmemperlihatkan adanya sel parenkim, sel parenkim berisi pigmen coklat, sel propagule bersel satu, sel propagule bersel dua dan sel propagule bersel tiga.

4.2.3 Hasil pemeriksaan karakterisasi serbuk simplisia

Hasil karakteristik serbuk simplisia rumput laut coklat Sargassum illicifolium Turner C. Agardmeliputi pemeriksaan kadar air, kadar sari larut air, kadar sari larut etanol, kadar abu total dan kadar abu tidak larut asam. Hasilnya dapat dilihat pada Tabel 3.1 berikut. Universitas Sumatera Utara