UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dengan cara melarutkan 6,4 g Actino 1 pada 800 mL aquadest. Masing – masing
medium disterilisasi dengan autoklaf 121 C, selama 15 menit.
Setiap isolat Aktinomisetes dikultivasi dalam 50 mL medium Yeast Starch Broth YSB dan Actino 1 pada erlenmeyer 100 mL, kemudian diinkubasi pada
shaker incubator dengan kekuatan 1300 rpm pada suhu 28 C selama 7 hari.
3.3.3 Ekstraksi Kultur Aktinomisetes
Setelah 1 minggu 30 kultur Aktinomisetes serta medium YSB Yeast Starch Broth dan Actino 1 sebagai kontrol diekstraksi 3 kali dengan pelarut etil asetat :
metanol 4:1 dalam corong pisah. Setelah dikocok terbentuk 2 lapisan, lalu lapisan
etil asetat : metanol dipisahkan dan diuapkan dengan rotary evaporator. Ekstrak yang
didapat dianalisis dengan kromatografi lapis tipis KLT menggunakan fase gerak diklorometan : metanol 10 : 1. Pola kromatogram yang terbentuk kemudian
dimonitor dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm, lalu disemprot dengan pereaksi penampak bercak serium sulfat.
3.3.4 Skrining Aktinomisetes Penghasil Antibakteri
3.3.4.1 Persiapan Bioautografi
Alat dan medium yang akan digunakan disterilisasi dengan menggunakan autoklaf 121
C selama 15 menit. Medium yang digunakan yaitu BHI Brain Heart Infusion, aquadest dan alat
– alat yang dipersiapkan antara lain cawan petri, potongan tissue kecil 2 x 2 cm dan dimasukkan dalam cawan petri, spreader.
3.3.4.2 Pembuatan Suspensi Bakteri
Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli masing – masing
diinokulasi pada medium BHI Brain Heart Infusion sebanyak 1 ose, lalu diinkubasi di dalam shaker incubator dengan temperatur 37
o
C kecepatan 100 rpm selama 20 jam.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.4.3 Pembuatan Larutan Kloramfenikol
Kloramfenikol dibuat dengan konsentrasi 1 mgmL dengan cara menimbang 10 mg kloramfenikol dan dilarutkan dalam 10 mL metanol.
3.3.4.4 Persiapan Plat KLT
Masing – masing ekstrak dengan konsentrasi 10 mgmL ditotol pada plat KLT
sebanyak 10 µL dengan jarak tiap totolan 1,5 cm. Kemudian plat disimpan dalam oven suhu 37
C selama 1 jam.
3.3.4.5 Uji Bioautografi Nonelusi Antibakteri
Suspensi bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli masing –
masing diambil sebanyak 5 mL dan dicampur dengan BHI masing – masing 45 mL
dalam petri dish dan diratakan dengan menggunakan spreader. Plat yang sudah disiapkan dicelupkan selama 5 detik ke dalam media BHI
yang sudah dicampur dengan suspensi bakteri, kemudian disimpan dalam petri dish yang sudah terdapat tissue yang dibasahi dengan aquadest. Lalu diinkubasi selama 20
jam pada suhu 37 C. Kemudian plat disemprot dengan larutan p-
iodonitrotetrazolium violet INT, lalu diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
o
C. Aktivitas antibakteri terlihat dengan terbentuknya zona bening dengan latar belakang
warna ungu pada plat. Pengerjaan bioautorafi dilakukan dalam laminar air flow Choma, 2010; Valgas, et al., 2007
3.3.4.6 Bioautografi Elusi
