Persiapan Medium Persiapan Sampel Uji Persiapan Kontrol Persiapan Suspensi Bakteri Uji

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3.6.3 Ektraksi Kultur Hasil Scaling Up

Kultur hasil scaling up InaCC A 75 digabung menjadi satu dalam erlenmeyer 5 L dan diekstraksi menggunakan etil asetat sebanyak 2 L dengan cara dikocok menggunakan stirrer selama kurang lebih 1 jam, selanjutnya fase etil asetat yang merupakan lapisan atas dipisahkan dengan menggunakan selang sedangkan lapisan bawah diekstraksi kembali dengan etil asetat sampai 3 kali. Fase etil asetat dipekatkan dengan rotary evaporator. Fraksi yang telah pekat dianalisis menggunakan KLT dengan fase gerak diklorometan : metanol 10:1 dan hasil elusi diamati dibawah sinar UV 254 nm dan 366 nm serta disemprot menggunakan pereaksi penampak bercak serium sulfat.

3.3.7 Isolasi dan Pemurnian Senyawa Aktif Ekstrak InaCC A75

Ekstrak InaCC A75 115 mg dilakukan fraksinasi dengan kromatografi kolom menggunakan fase diam silica gel mesh 70 – 230 dan fase gerak kloroform : etanol 10:1. Fraksi ditampung dalam tabung reaksi, dan setiap fraksi diamati pola bercak KLT dengan fase gerak kloroform : etanol 10:1 . Fraksi yang menunjukkan pola bercak yang sama digabung menjadi 1 fraksi sehingga didapatkan 10 fraksi. Selanjutnyak fraksi yang menunjukkan spot target dilakukan fraksinasi lebih lanjut menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam Sephadex LH 20 dan fase gerak etanol 96, dimana kolom yang digunakan mempunyai panjang 100 cm dengan diameter 0,7 cm. Fraksi ditampung dalam tabung reaksi dan diamati dengan KLT menggunakan fase gerak kloroform : etanol 10:1 , fraksi yang menunjukkan pola bercak yang sama digabung menjadi 1 fraksi.

3.3.8 Penentuan Nilai MIC Minimum Inhibitory Concentration

3.3.8.1 Persiapan Medium

Medium yang digunakan dalam uji antibakteri yaitu medium MHB dan MHA. a. Medium MHB dibuat 2 konsentrasi yang berbeda, MHB 1 dibuat sebanyak 2,1 g MHB dilarutkan dalam 100 mL aquadest, sedangkan MHB 2 dibuat dengan konsentrasi 2 kali MHB 1, sebanyak 2,1 g MHB dilarutkan dalam 50 mL UIN Syarif Hidayatullah Jakarta aquadest, kemudian dipanaskan agar larut sempurna dan disterilisasi pada autoklaf suhu 121 C selama 15 menit. b. Medium MHA dibuat dengan melarutkan 3,8 g MHA dengan 100 mL aquadest, kemudian disterilkan pada autoklaf suhu 121 C selama 15 menit. Setelah itu dituang pada petri dish yang sudah steril.

3.3.8.2 Persiapan Sampel Uji

Sampel uji yang digunakan yaitu F4.2 yang merupakan spot tunggal dan F5.4. Sampel uji dibuat dengan konsentrasi 512 µgmL sebanyak 1 mL menggunakan DMSO 30 . F4.2 7,5 mg dilarutkan dalam 3,75 mL etanol 96, diambil 256 µL kemudian dikeringan dengan nitrogen dan dilarutkan dengan 300 µL DMSO serta 700 µL aquadest. Sedangkan F5.4 2,4 mg dilarutkan dalam 2,4 mL etanol 96, dipipet 512 µL dan dikeringkan, selanjutnya dilarutkan dalam 300 µL DMSO dan 700 µL aquadest

3.3.8.3 Persiapan Kontrol

Kontrol positif menggunakan antibiotik komersial kloramfenikol dan eritromisin yang masing – masing dibuat dengan konsentrasi 10 mgmL yang dilarutkan dalam etanol 96 sebagai larutan stok, kemudian diencerkan menjadi konsentrasi 512 µgmL sebanyak 5 mL, dengan cara menambahkan 4744 µL aquadest ke dalam 256 µL larutan stok. Kontrol negatif menggunakan etanol 20 dan DMSO 30 yang dipersiapkan dengan cara 200 µL etanol dicampur dengan 800 µL aquadest dan 300 µL DMSO dilarutkan dengan 700 µL aquadest.

3.3.8.4 Persiapan Suspensi Bakteri Uji

Bakteri uji yang digunakan yaitu Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Masing – masing bakteri diinokulasi sebanyak 1 ose dalam 20 mL medium MHB dan diinkubasi pada shaker incubator dengan kecepatan 100 rpm suhu 37 C selama 20 jam. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Suspensi bakteri yang diperoleh dilakukan pengenceran agar mudah dalam perhitungan jumlah koloni dengan cara 50 µL suspensi bakteri dimasukan ke dalam 4950 µL aquadest steril sehingga didapat pengenceran 10 -2 , pengenceran dilakukan hingga diperoleh pengenceran 10 -10 . Pada pengenceran 10 -6 , 10 -8 , dan 10 -10 diambil 100 µL dan masing – masing ditanam pada medium MHA. Selanjutnya diinkubasi selama 20 jam pada suhu 37 C. Setelah dinkubasi dilakukan perhitungan koloni bakteri dengan rumus: Jumlah koloni =

3.3.8.5 Pengenceran Suspensi Bakteri