Peremajaan Isolat Aktinomisetes Kultivasi Aktinomisetes Ekstraksi Kultur Aktinomisetes Identifikasi Bakteri Uji

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 3.1 Data Isolat Aktinomisetes N0 Isolat Sumber sampel Asal sampel Identifikasi spesies 1 InaCC A63 Tanah Taman Nasional Alas Purwo, Jawa Timur Streptomyces sp. 2 InaCC A64 Tanah Taman Nasional Alas Purwo, Jawa Timur Streptomyces sp. 3 InaCC A67 Tanah Taman Nasional Alas Purwo, Jawa Timur Streptomyces sp. 4 InaCC A72 Tanah Taman Nasional Alas Purwo, Jawa Timur Streptomyces sp. 5 InaCC A74 Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp. 6 InaCC A75 Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp. 7 InaCC A78 Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp. 8 InaCC A82 Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp. 9 InaCC A83 Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp. 10 InaCC A85 Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp. 11 InaCC A89 Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp. 12 InaCC A94 Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp. 13 InaCC A0112 Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp. 14 InaCC A0114 Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp. 15 InaCC A0116 Tanah Raja Ampat, Papua Streptomyces sp.

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Peremajaan Isolat Aktinomisetes

Lima belas isolat Aktinomisetes ditumbuhkan pada medium Yeast Starch Agar YSA yang dibuat dengan cara 0,5 g yeast extract, 2,5 g pati dan 3,75 agar yang dilarutkan dalam 250 mL aquadest. Medium YSA sebelumnya disterilkan pada autoklaf 121 C selama 15 menit.

3.3.2 Kultivasi Aktinomisetes

Pembuatan medium YSB dengan cara melarutkan 1,6 g yeast extract dan 8 g pati yang dilarutkan dalam 800 mL aquadest. Sedangkan medium Actino 1 dibuat UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dengan cara melarutkan 6,4 g Actino 1 pada 800 mL aquadest. Masing – masing medium disterilisasi dengan autoklaf 121 C, selama 15 menit. Setiap isolat Aktinomisetes dikultivasi dalam 50 mL medium Yeast Starch Broth YSB dan Actino 1 pada erlenmeyer 100 mL, kemudian diinkubasi pada shaker incubator dengan kekuatan 1300 rpm pada suhu 28 C selama 7 hari.

3.3.3 Ekstraksi Kultur Aktinomisetes

Setelah 1 minggu 30 kultur Aktinomisetes serta medium YSB Yeast Starch Broth dan Actino 1 sebagai kontrol diekstraksi 3 kali dengan pelarut etil asetat : metanol 4:1 dalam corong pisah. Setelah dikocok terbentuk 2 lapisan, lalu lapisan etil asetat : metanol dipisahkan dan diuapkan dengan rotary evaporator. Ekstrak yang didapat dianalisis dengan kromatografi lapis tipis KLT menggunakan fase gerak diklorometan : metanol 10 : 1. Pola kromatogram yang terbentuk kemudian dimonitor dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm, lalu disemprot dengan pereaksi penampak bercak serium sulfat.

3.3.4 Skrining Aktinomisetes Penghasil Antibakteri

3.3.4.1 Persiapan Bioautografi

Alat dan medium yang akan digunakan disterilisasi dengan menggunakan autoklaf 121 C selama 15 menit. Medium yang digunakan yaitu BHI Brain Heart Infusion, aquadest dan alat – alat yang dipersiapkan antara lain cawan petri, potongan tissue kecil 2 x 2 cm dan dimasukkan dalam cawan petri, spreader.

3.3.4.2 Pembuatan Suspensi Bakteri

Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli masing – masing diinokulasi pada medium BHI Brain Heart Infusion sebanyak 1 ose, lalu diinkubasi di dalam shaker incubator dengan temperatur 37 o C kecepatan 100 rpm selama 20 jam. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3.4.3 Pembuatan Larutan Kloramfenikol

Kloramfenikol dibuat dengan konsentrasi 1 mgmL dengan cara menimbang 10 mg kloramfenikol dan dilarutkan dalam 10 mL metanol.

3.3.4.4 Persiapan Plat KLT

Masing – masing ekstrak dengan konsentrasi 10 mgmL ditotol pada plat KLT sebanyak 10 µL dengan jarak tiap totolan 1,5 cm. Kemudian plat disimpan dalam oven suhu 37 C selama 1 jam.

3.3.4.5 Uji Bioautografi Nonelusi Antibakteri

Suspensi bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli masing – masing diambil sebanyak 5 mL dan dicampur dengan BHI masing – masing 45 mL dalam petri dish dan diratakan dengan menggunakan spreader. Plat yang sudah disiapkan dicelupkan selama 5 detik ke dalam media BHI yang sudah dicampur dengan suspensi bakteri, kemudian disimpan dalam petri dish yang sudah terdapat tissue yang dibasahi dengan aquadest. Lalu diinkubasi selama 20 jam pada suhu 37 C. Kemudian plat disemprot dengan larutan p- iodonitrotetrazolium violet INT, lalu diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 o C. Aktivitas antibakteri terlihat dengan terbentuknya zona bening dengan latar belakang warna ungu pada plat. Pengerjaan bioautorafi dilakukan dalam laminar air flow Choma, 2010; Valgas, et al., 2007

3.3.4.6 Bioautografi Elusi

Ekstrak yang menunjukkan aktivitas antibakteri isolat A64, A67, A75, A89 dan A94 selanjutnya diuji kembali dengan cara ekstrak konsentrasi 10 mgmL ditotolkan pada plat sebanyak 10 µL dengan jarak setiap totolan 1,5 cm dan dielusi dengan fase gerak Diklorometan : Metanol 10:1 , lalu dilihat dibawah sinar UV 254 nm dan 366 nm dan menandai bercak yang terlihat. Selanjutnya plat disimpan dalam oven selama 1 jam dengan suhu 37 C. Plat yang telah disimpan dalam oven, dicelupkan dalam campuran BHI dan suspensi bakteri selama 5 detik, selanjutnya UIN Syarif Hidayatullah Jakarta disimpan dalam petri dish dan diletakkan tissue yang dibasahi dengan aquadest. Plat diinkubasi pada suhu 37 C selama 20 jam, setelah diinkubasi plat disemprot dengan larutan p-iodonitrotetrazolium violet INT, dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 o C.

3.3.5 Identifikasi Bakteri Uji

Identifikasi bakteri uji dilakukan dengan cara pewarnaan bakteri. Kaca objek dibersihkan dengan alkohol 70 dan dikeringkan, dibuat preparat sampel diatas kaca objek dan dikeringkan didekat api. Diteteskan kristal violet di atas preparat, didiamkan selama 60 detik dan dibilas dengan air mengalir, diteteskan kembali dengan iodin, didiamkan 60 detik, dibilas dengan air mengalir, selanjutnya preparat ditetesi dengan alkohol 96 dan langsung dibilas dengan air mengalir, dan yang terakhir ditetesi menggunakan safranin, didiamkan 60 detik dan dibilas menggunakan air mengalir. Preparat dikeringkan dan diamati pada mikroskop.

3.3.6 Scaling Up Isolat InaCC A 75 dalam Medium Actino 1