UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 3.1 Data Isolat Aktinomisetes
N0 Isolat
Sumber sampel
Asal sampel Identifikasi spesies
1 InaCC A63
Tanah Taman Nasional Alas
Purwo, Jawa Timur Streptomyces sp.
2 InaCC A64
Tanah Taman Nasional Alas
Purwo, Jawa Timur Streptomyces sp.
3 InaCC A67
Tanah Taman Nasional Alas
Purwo, Jawa Timur Streptomyces sp.
4 InaCC A72
Tanah Taman Nasional Alas
Purwo, Jawa Timur Streptomyces sp.
5 InaCC A74
Tanah Raja Ampat, Papua
Streptomyces sp. 6
InaCC A75 Tanah
Raja Ampat, Papua Streptomyces sp.
7 InaCC A78
Tanah Raja Ampat, Papua
Streptomyces sp. 8
InaCC A82 Tanah
Raja Ampat, Papua Streptomyces sp.
9 InaCC A83
Tanah Raja Ampat, Papua
Streptomyces sp. 10
InaCC A85 Tanah
Raja Ampat, Papua Streptomyces sp.
11 InaCC A89
Tanah Raja Ampat, Papua
Streptomyces sp. 12
InaCC A94 Tanah
Raja Ampat, Papua Streptomyces sp.
13 InaCC
A0112 Tanah
Raja Ampat, Papua Streptomyces sp.
14 InaCC
A0114 Tanah
Raja Ampat, Papua Streptomyces sp.
15 InaCC
A0116 Tanah
Raja Ampat, Papua Streptomyces sp.
3.3 Prosedur Kerja
3.3.1 Peremajaan Isolat Aktinomisetes
Lima belas isolat Aktinomisetes ditumbuhkan pada medium Yeast Starch Agar YSA yang dibuat dengan cara 0,5 g yeast extract, 2,5 g pati dan 3,75 agar
yang dilarutkan dalam 250 mL aquadest. Medium YSA sebelumnya disterilkan pada autoklaf 121
C selama 15 menit.
3.3.2 Kultivasi Aktinomisetes
Pembuatan medium YSB dengan cara melarutkan 1,6 g yeast extract dan 8 g pati yang dilarutkan dalam 800 mL aquadest. Sedangkan medium Actino 1 dibuat
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dengan cara melarutkan 6,4 g Actino 1 pada 800 mL aquadest. Masing – masing
medium disterilisasi dengan autoklaf 121 C, selama 15 menit.
Setiap isolat Aktinomisetes dikultivasi dalam 50 mL medium Yeast Starch Broth YSB dan Actino 1 pada erlenmeyer 100 mL, kemudian diinkubasi pada
shaker incubator dengan kekuatan 1300 rpm pada suhu 28 C selama 7 hari.
3.3.3 Ekstraksi Kultur Aktinomisetes
Setelah 1 minggu 30 kultur Aktinomisetes serta medium YSB Yeast Starch Broth dan Actino 1 sebagai kontrol diekstraksi 3 kali dengan pelarut etil asetat :
metanol 4:1 dalam corong pisah. Setelah dikocok terbentuk 2 lapisan, lalu lapisan
etil asetat : metanol dipisahkan dan diuapkan dengan rotary evaporator. Ekstrak yang
didapat dianalisis dengan kromatografi lapis tipis KLT menggunakan fase gerak diklorometan : metanol 10 : 1. Pola kromatogram yang terbentuk kemudian
dimonitor dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm, lalu disemprot dengan pereaksi penampak bercak serium sulfat.
3.3.4 Skrining Aktinomisetes Penghasil Antibakteri
3.3.4.1 Persiapan Bioautografi
Alat dan medium yang akan digunakan disterilisasi dengan menggunakan autoklaf 121
C selama 15 menit. Medium yang digunakan yaitu BHI Brain Heart Infusion, aquadest dan alat
– alat yang dipersiapkan antara lain cawan petri, potongan tissue kecil 2 x 2 cm dan dimasukkan dalam cawan petri, spreader.
3.3.4.2 Pembuatan Suspensi Bakteri
Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli masing – masing
diinokulasi pada medium BHI Brain Heart Infusion sebanyak 1 ose, lalu diinkubasi di dalam shaker incubator dengan temperatur 37
o
C kecepatan 100 rpm selama 20 jam.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.4.3 Pembuatan Larutan Kloramfenikol
Kloramfenikol dibuat dengan konsentrasi 1 mgmL dengan cara menimbang 10 mg kloramfenikol dan dilarutkan dalam 10 mL metanol.
3.3.4.4 Persiapan Plat KLT
Masing – masing ekstrak dengan konsentrasi 10 mgmL ditotol pada plat KLT
sebanyak 10 µL dengan jarak tiap totolan 1,5 cm. Kemudian plat disimpan dalam oven suhu 37
C selama 1 jam.
3.3.4.5 Uji Bioautografi Nonelusi Antibakteri
Suspensi bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli masing –
masing diambil sebanyak 5 mL dan dicampur dengan BHI masing – masing 45 mL
dalam petri dish dan diratakan dengan menggunakan spreader. Plat yang sudah disiapkan dicelupkan selama 5 detik ke dalam media BHI
yang sudah dicampur dengan suspensi bakteri, kemudian disimpan dalam petri dish yang sudah terdapat tissue yang dibasahi dengan aquadest. Lalu diinkubasi selama 20
jam pada suhu 37 C. Kemudian plat disemprot dengan larutan p-
iodonitrotetrazolium violet INT, lalu diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
o
C. Aktivitas antibakteri terlihat dengan terbentuknya zona bening dengan latar belakang
warna ungu pada plat. Pengerjaan bioautorafi dilakukan dalam laminar air flow Choma, 2010; Valgas, et al., 2007
3.3.4.6 Bioautografi Elusi
Ekstrak yang menunjukkan aktivitas antibakteri isolat A64, A67, A75, A89 dan A94 selanjutnya diuji kembali dengan cara ekstrak konsentrasi 10 mgmL
ditotolkan pada plat sebanyak 10 µL dengan jarak setiap totolan 1,5 cm dan dielusi dengan fase gerak Diklorometan : Metanol 10:1 , lalu dilihat dibawah sinar UV 254
nm dan 366 nm dan menandai bercak yang terlihat. Selanjutnya plat disimpan dalam oven selama 1 jam dengan suhu 37
C. Plat yang telah disimpan dalam oven, dicelupkan dalam campuran BHI dan suspensi bakteri selama 5 detik, selanjutnya
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
disimpan dalam petri dish dan diletakkan tissue yang dibasahi dengan aquadest. Plat diinkubasi pada suhu 37
C selama 20 jam, setelah diinkubasi plat disemprot dengan larutan p-iodonitrotetrazolium violet INT, dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu
37
o
C.
3.3.5 Identifikasi Bakteri Uji
Identifikasi bakteri uji dilakukan dengan cara pewarnaan bakteri. Kaca objek dibersihkan dengan alkohol 70 dan dikeringkan, dibuat preparat sampel diatas kaca
objek dan dikeringkan didekat api. Diteteskan kristal violet di atas preparat, didiamkan selama 60 detik dan dibilas dengan air mengalir, diteteskan kembali
dengan iodin, didiamkan 60 detik, dibilas dengan air mengalir, selanjutnya preparat ditetesi dengan alkohol 96 dan langsung dibilas dengan air mengalir, dan yang
terakhir ditetesi menggunakan safranin, didiamkan 60 detik dan dibilas menggunakan air mengalir. Preparat dikeringkan dan diamati pada mikroskop.
3.3.6 Scaling Up Isolat InaCC A 75 dalam Medium Actino 1