UIN Syarif Hidayatullah Jakarata
agar, berbagai konsentrasi senyawa uji dicampur dengan nutrient agar. Plat agar diinokulasi kemudian diinkubasi. Konsentrasi terendah dari senyawa antimikroba,
dimana tidak ada pertumbuhan mikroorganisme terdeteksi, diberikan nilai MIC. Dalam tabung uji, berbagai konsentrasi senyawa uji dicampur dengan suspensi
bakteri pada beberapa tabung, konsentrasi terendah menyebabkan penghambatan pertumbuhan mikroorganisme sesuai dengan nilai MIC. Pada uji mikrodilusi cair,
mikroorganisme yang tumbuh di sumur plat, dimana berbagai konsentrasi senyawa uji ditambahkan. Pertumbuhan mikroorganisme ditunjukkan oleh adanya
kekeruhan dalam sumur Choma, 2010.
2.4.3 Metode Bioautografi
Bioautografi merupakan metode skrining mikrobiologi yang umum digunakan untuk mendeteksi aktivitas antimikroba. Skrining dapat didefinisikan
sebagai prosedur pertama, yang diterapkan pada sampel yang dianalisis, dalam rangka untuk menetapkan ada atau tidak adanya analit yang didapat. Metode
skrining ini memberikan sensitivitas yang lebih tinggi daripada metode lainnya. Selain itu, sederhana, murah, hemat waktu dan tidak memerlukan peralatan yang
canggih Choma, 2010. Prosedur bioautografi untuk skrining aktivitas antimikroba dengan
mengetahui lokasi aktivitas antibakteri pada kromatogram. Agen antimikroba ditransfer dari lempeng KLT atau kertas kromatogram ke plat agar yang
diinokulasi dengan cara difusi dan menampakkan zona hambat Rahman, et al., 2005.
Menurut Choma 2005 Skrining metode bioautografi pada dasarnya untuk menguji aktivitas biologis, misalnya antibakteri, antijamur, antitumor, dan
antiprotozoa zat uji. Metode deteksi ini dapat berhasil dengan dikombinasikan dengan teknik kromatografi lapis tipis Choma, 2010.
Prosedur dalam metode bioautografi hampir sama dengan yang digunakan dalam metode difusi agar. Perbedaannya adalah senyawa yang diuji berdifusi ke
media agar yang diinokulasi dari lapisan kromatografi, yang merupakan adsorben atau kertas Wagman, 1969; Choma, 2010.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarata
Metode bioautografi dibedakan menjadi bioautografi kontak, bioautografi imersi atau bioautografi agar overlay, dan bioautografi langsung. Dalam
bioautografi kontak, lempeng KLT atau kromatogram kertas ditempatkan pada permukaan agar diinokulasi selama beberapa menit atau jam untuk
memungkinkan difusi. Selanjutnya, lempeng dipindah dan lapisan agar diinkubasi. Pertumbuhan zona hambat muncul di mana senyawa antimikroba
berada dalam kontak dengan lapisan agar. Dalam bioautografi immersion agar overlay, lempeng pertama kali
dicelupkan di atau ditutup dengan medium agar, setelah agar memadat, ditambahkan mikroorganisme yang diuji dan kemudian diinkubasi. Agar dapat
berdifusi dengan baik dari senyawa uji ke permukaan agar, lempeng dapat tetap pada suhu rendah selama beberapa jam sebelum inkubasi. Metode ini merupakan
kombinasi dari bioautografi kontak dan langsung, karena senyawa antimikroba yang ditransfer dari kromatogram ke media agar, seperti dalam metode kontak,
tetapi lapisan agar tetap pada permukaan kromatogram selama inkubasi dan visualisasi, sebagai bioautografi langsung Choma, 2010.
Di antara semua metode bioautografi, yang paling banyak digunakan adalah bioautografi langsung. Prinsip dari metode ini adalah lempeng KLT
dicelupkan pada suspensi mikroorganisme yang tumbuh dalam kaldu yang tepat dan kemudian diinkubasi dalam suasana lembab. Permukaan silika dari lempeng
KLT ditutupi dengan media kaldu menjadi sumber nutrisi dan memungkinkan pertumbuhan mikroorganisme secara langsung di atasnya, daerah di mana terdapat
spot agen antimikroba menunjukan zona penghambatan pertumbuhan mikroorganisme yang terbentuk. Visualisasi dari zona ini biasanya dilakukan
dengan menggunakan reagen dehidrogenase untuk deteksi aktivitas, yang paling umum adalah garam tetrazolium. Dehidrogenase mengkonversi mikroorganisme
hidup garam tetrazolium menjadi berwarna. Sehingga, spot krim - putih muncul dengan latarbelakang ungu pada permukaan lempeng KLT menunjukkan
keberadaan agen antibakteri Choma, 2010. Reaksi berdasarkan transfer electron dari NADH, produk dari threonine dehydrogenase TDH yang mengkatalis
reaksi. TDH dari bakteri fungi mengkatalis NAD
+
dari threonine menjadi 2- amino-3-ketobutirat dan NADH. Selama pertumbuhan bakteri aktif, elektron
UIN Syarif Hidayatullah Jakarata
ditransfer dari NADH yang berwarna pada daerah tampak ke p- iodonitrotetrazolium violet menghasilkan pewarna formazan yang berwarna ungu.
Sehingga zona bening pada kromatogram menunjukkan area inhibisi zona dimana tidak terdapat pertumbuhan aktif bakteri Angeh, 2006.
Keuntungan dari metode bioautografi adalah sifatnya yang efisien untuk mendeteksi adanya senyawa antimikroba karena letak bercak dapat ditentukan
walaupun berada dalam campuran yang kompleks sehingga memungkinkan untuk mengisolasi senyawa aktif tersebut Pratiwi, 2008.
2.5 Kromatografi