26
terbentuk dipindahkan ke tabung mikrotube baru, dan ditambahi sodium asetat 0.2 M sebanyak 0.1 kali volume larutan dan etanol absolut sebanyak 2 kali volume
larutan, tabung dibolak-balik beberapa kali, kemudian disimpan dalam esfreezer -20
ο
C selama semalam. Kemudian, tabung disentrifugasi lagi pada kecepatan 10000 rpm selama 20 menit, supernatan dibuang dan endapan yang terbentuk
ditambahi dengan 1 ml etanol 70 vv dan disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit, kemudian endapan DNA dikeringkan dan diberi
ddH
2
O dan RNAse 1 mgml.
3.2.7 Deteksi dengan PCR
DNA yang telah diisolasi kemudian digunakan untuk analisis DNA dengan PCR dengan menggunakan primer 3UTRact, hpt, Ubiquitin-Nos, dan SMt2.
Volume satu campuran reaksi PCR berjumlah 10 μl terdiri dari 1 μl template
DNA yang telah diencerkan 1:10, 5 μl Dream Taq
TM
Green PCR Master Mix 2x, 0.25
μl primer forward 10 pmolμl, 0.25 μl primer reverse 10 pmolμl, dan 3.5
μl akuabides. Amplifikasi dilakukan menggunakan mesin PCR Applied Biosystem dengan kondisi PCR terdiri dari pra PCR 94
ο
C selama 5 menit, dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 94
ο
C selama 2 menit, annealing pada suhu 60
ο
C selama 1 menit 20 detik, extension pada suhu 72
ο
selama 1 menit dan keseluruhan rangkaian dilakukan sebanyak 30 siklus, dan diakhiri dengan pasca
PCR pada suhu 72
ο
selama 5 menit. Hasil PCR dielektroforesis pada gel agarosa 1 bv pada voltase 100 volt selama 30 menit. Selanjutnya gel direndam dalam
larutan etidium bromide 0.5 mg L
-1
. Visualisasi pita amplikon diamati pada UV transilluminator setelah gel diwarnai dengan etidium bromide. Hasil foto
elektroforesis didokumentasikan dengan gel-doc.
27
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Transformasi genetik Oryza sativa L. dengan gen MaMt2
Transformasi genetik Oryza sativa L. kultivar Kasalath dan Nipponbare dilakukan menggunakan eksplan yang berupa kalus skutella yang diperoleh dari
biji padi mature seeds. Kalus ini diperoleh dari skutella yang ditumbuhkan pada media induksi kalus yaitu 2N6 yang mengandung zat pengatur tumbuh ZPT 2.4
D dengan konsentrasi 2.0 mgL. 2,4 D merupakan salah satu zat pengatur tumbuh yang digunakan secara luas untuk menginduksi kalus Toki et al. 2006; Hiei dan
Komari 2008; Wanichanan et al. 2010. Kalus mulai terbentuk pada hari ketiga untuk kultivar Kasalath dan Nipponbare, hal ini sesuai dengan yang dilakukan
oleh Toki et al. 2006, penggunaan 2,4 D konsentrasi 2.0 mgL pada proses induksi kalus dari biji padi Kasalath, menunjukkan diferensiasi sel kalus mulai
terbentuk pada hari ketiga. Kalus yang dapat ditransformasi minimal berumur 3 - 4 minggu, dengan penampakan fisik kalus berbentuk butiran globular berwarna
kuning muda cerah dengan ukuran 3 mm Gambar 8.
Gambar 8 Tahapan induksi kalus dari biji Oryza sativa L. kultivar Kasalath pada media 2N6 yang diperkaya dengan zat pengatur tumbuh ZPT
2.4 D, A. biji Oryza sativa L. gabah, B. biji padi Kasalath. ditanam dalam media 2N6. C. kalus berumur ± 2 minggu dengan
ukuran 3 mm, D. kalus berumur 1 bulan dengan ukuran 3 mm.
Penggunaan eksplan yang berupa kalus dari biji mature seed pada transformasi genetik Oryza sativa L. dengan perantara A. tumefaciens, memiliki
beberapa kelebihan yaitu lebih mudah dilakukan karena dapat diproduksi dalam jumlah yang banyak dan selalu tersedia setiap waktu di laboratorium Hiei dan
Komari 2008.
