25
Komari 2008, Lampiran 4 dengan densitas sel 1 x 10
8
CFU OD = 0,01 pada λ
600 nm. Kalus-kalus yang siap ditransformasikan dipindahkan dari media induksi kalus ke cawan petri steril yang berisi 5 ml air steril dilakukan perendaman.
Setelah itu, air steril yang digunakan untuk proses perendaman dibuang, kemudian 1 ml inokulum bakteri ditambahkan ke kalus dan dibiarkan selama 2-5 menit.
Kalus dipindahkan ke media kokultivasi 2N6-As yang mengandung 100 mg L
-1
asetosiringon Hiei dan Komari 2008, Lampiran 5. Ko-kultivasi ini dilakukan selama 3 hari pada suhu 28
ο
C pada kondisi gelap.
3.2.3 Seleksi
Setelah diinkubasi selama 3 hari pada media kokultivasi, kalus dipindahkan ke media seleksi. Seleksi dilakukan dua tahap. Seleksi I dilakukan pada media
2NBKCH20 Hiei dan Komari 2008, Lampiran 6 dan diinkubasi pada suhu 28
ο
C dalam kondisi terang selama dua puluh hari. Kalus yang hidup dari seleksi I
dengan kondisi kalus berwarna putih kekuningan yang berproliferasi dipindahkan ke media seleksi II yaitu nN6CH30 Hiei dan Komari 2008, Lampiran 7 dan
diinkubasi selama 10 hari pada kondisi terang dan suhu 28
ο
C.
3.2.4 Regenerasi dan Pengakaran
Kalus-kalus yang berdiameter 0.5 – 1.0 mm dipindahkan ke media regenerasi 2N6R Hiei dan Komari 2008, Lampiran 8. Inkubasi dilakukan selama
± 8 minggu dalam kondisi terang pada suhu 28
ο
C. Tunas yang tumbuh dipindahkan ke media induksi akar 2N6F Hiei dan Komari 2008, Lampiran 9
dan diinkubasi selama 1-2 minggu dalam kondisi terang pada suhu 28
ο
C.
3.2.5 Aklimatisasi
Tanaman transgenik putatif yang diperoleh kemudian dipindahkan ke pot berisi campuran tanah dan kompos, selanjutnya ditumbuhkan di rumah kaca.
3.2.6 Isolasi DNA Genom
Daun tanaman padi yang masih muda ditimbang sebanyak 0,1 gram dan dimasukkan ke dalam mortar dan digerus hingga halus dengan bantuan nitrogen
cair. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung mikrotube eppendorf ukuran 1.5 ml dan ditambahi dengan buffer 2 x CTAB1 M Tris pH 7.5, 5 M NaCl, 0.5 M
EDTA pH 8.0, dan β-merkaptoetanol 0.2. Tabung dibolak-balik beberapa kali
dan diinkubasikan pada suhu 65
ο
C selama 30 menit. Tabung disimpan di dalam es, kemudian, ditambahi kloroform-isoamil alkohol 24:1vv sebanyak 1 kali
volume larutan, dan disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm Jouan BR 4i selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh, dipindahkan ke dalam tabung
mikrotube 1.5 ml, dan ditambahi PCI phenol-choroform-isoamil alkohol 25:24:21 vvv sebanyak 1 kali volume larutan, dibolak-balik dan disentrifugasi
kembali dengan kecepatan 10000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang
26
terbentuk dipindahkan ke tabung mikrotube baru, dan ditambahi sodium asetat 0.2 M sebanyak 0.1 kali volume larutan dan etanol absolut sebanyak 2 kali volume
larutan, tabung dibolak-balik beberapa kali, kemudian disimpan dalam esfreezer -20
ο
C selama semalam. Kemudian, tabung disentrifugasi lagi pada kecepatan 10000 rpm selama 20 menit, supernatan dibuang dan endapan yang terbentuk
ditambahi dengan 1 ml etanol 70 vv dan disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit, kemudian endapan DNA dikeringkan dan diberi
ddH
2
O dan RNAse 1 mgml.
3.2.7 Deteksi dengan PCR
DNA yang telah diisolasi kemudian digunakan untuk analisis DNA dengan PCR dengan menggunakan primer 3UTRact, hpt, Ubiquitin-Nos, dan SMt2.
Volume satu campuran reaksi PCR berjumlah 10 μl terdiri dari 1 μl template
DNA yang telah diencerkan 1:10, 5 μl Dream Taq
TM
Green PCR Master Mix 2x, 0.25
μl primer forward 10 pmolμl, 0.25 μl primer reverse 10 pmolμl, dan 3.5
μl akuabides. Amplifikasi dilakukan menggunakan mesin PCR Applied Biosystem dengan kondisi PCR terdiri dari pra PCR 94
ο
C selama 5 menit, dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 94
ο
C selama 2 menit, annealing pada suhu 60
ο
C selama 1 menit 20 detik, extension pada suhu 72
ο
selama 1 menit dan keseluruhan rangkaian dilakukan sebanyak 30 siklus, dan diakhiri dengan pasca
PCR pada suhu 72
ο
selama 5 menit. Hasil PCR dielektroforesis pada gel agarosa 1 bv pada voltase 100 volt selama 30 menit. Selanjutnya gel direndam dalam
larutan etidium bromide 0.5 mg L
-1
. Visualisasi pita amplikon diamati pada UV transilluminator setelah gel diwarnai dengan etidium bromide. Hasil foto
elektroforesis didokumentasikan dengan gel-doc.