Saran Genetic transformation of rice (Oryza sativa L.) with gene encoding Melastoma malabathricum metallothionein type II (MaMt2) using Agrobacterium tumefaciens-mediated transfer.

37 DAFTAR PUSTAKA Ahn YO, Kim SH, Lee J, Kim HR, Lee HS, Kwak SS. 2011. Three Brassica rapa metallothionein genes are differentially regulated under various stress conditions. Mol Biol Rep. DOI 10.1007s11033-011-0953-5 Aldemita PR, Hodges TK. 1996. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties. Planta 199:612- 617.doi:10.1007BF00195194 Anggraito YU, Suharsono, Pardal SJ, Sopandie D. 2012. Konstruksi vektor ekspresi gen MaMt2 penyandi metallothionein tipe II dan introduksinya ke dalam Nicotiana nenthamiana. Forum Pasca Sarjana 353:179-188. Bogor ID: Institut Pertanian Bogor.ISSN 0126-1886 Anggraito YU. 2012. Transformasi genetik Nicotiana benthamiana L. dan kedelai dengan gen MaMt2 penyandi metallothionein tipe II dari Melastoma malabathrricum L. [Disertasi]. BogorID: Institut Pertanian Bogor. Ankenbauer RG, Nester, EW. 1990. Sugar-mediated induction of Agrobacterium tumefaciens virulence genes: structural specificity and activities of monosaccharides. J Bacteriol 172: 6442-6446. Arockiasamy S, Ignacimuthu S. 2007. Regeneration of transgenic plants from two indica rice Oryza sativa L. cultivars using shoot apex explants. Plant Cell Reports 26:1745-1753.doi:10.1007s00299-007-0377-9 Asher CJ. 1991. Beneficial element functional nutrients and possible new essensial element. Di dalam: Mortvedt JJ, Cox FR, Shuman LM, Welch RM, editor. Micronutrients in agriculture. Ed ke-2. Winconsin US: The Soil Science Society of America Inc. hlm 703-731. Ashikari M, Matsuoka M, Datta SK. 2004. Transgenic rice plants. Di dalam Curtis IS, editor. Transgenic crops of the world: Essential Protocols. Dordrecht NL: Kluwer Academic Publishing. Bell LC, Edwards DG. 1987. The role of aluminum in acid soil infertility. Di dalam Latham M, editor. Soil management under humid condtion in Asia ASIALAND Proc. 1 st Regional Seminar Soil Management under humid condition in Asia and the Pasific Khon Kae; October 1986; Bangkok, Thailand TH: IBSRAM Inc. Birch RG. 1997. Plant transformation: problems and strategies for practical application. Annu Rev Plant Physiol 48:297-326. [BPS] Badan Pusat Statitik ID. 2011. Laporan bulanan: Data Sosial Ekonomi 18:36-37. 38 Bot AJ, Nachtergaele FO, Young A. 2000. Land resource potential and constraints at regional and country levels. Food and Agricultural Organization of the United Nations. Rome IT:114 p. Chang TJ, Chen L, Lu ZX, Chen WX, Liu X, Zhu Z. 2002. Cloning and expression of a metallothionein-like gene htMT2 of Helianthus tuberosus. Acta Bot Sin 4410:1188-1193. Chang TT. 2003. Origin, domestication, and diversification. Di dalam: Smith CW, Dilday RH, editor. Rice: origin, history, technology, and production. Chap 1.1. The United States of America US: JohnWiley Sons Inc. hlm 3-25. Caponetti, JD, Gray DJ, Trigiano RN. 2005. History of plant tissue and cell culture. Di dalam: Trigiano RN, Gray DJ, editor. Plant development and biotechnology Chap 2. The United States of America US: CRC Press LLC. hlm 9-16. Cobbett C, Goldbrough P. 2002. Phytochelatins and metallothioneins : roles in heavy metal detoxification and homeostatis. Ann Rev Plant Biol 53:159- 182.doi:10.1146annurev.arplant.53.100301.135154 Cousins RJ. 1983. Metallothionein-aspects related to copper and zinc metabolism. J Inher Metab Di. 6 Suppl 1: I5-21.ISSN 0141-8955 Datta SK. 1981. Principles and practices of rice production. Singapore SG: A wiley interscience publication. Davis LMM. 2012. Transformasi genetik padi japonica Oryza sativa L. subsp. japonica dengan gen penyandi superoksida dismutase dari Melastoma malabathricum menggunakan perantara Agrobacterium tumefaciens [Tesis]. Bogor ID: Institut Pertanian Bogor. Delhaize E, Ryan PR, Hebb DM, Yamamoto Y, Sasaki T, Matsumoto H. 2004. Engineering high level aluminum tolerance in barley with the ALMT1 gene. Proc Natl Acad Sci USA 10142: 15249-15254. Duncan KER, Ngu TT, Chan J, Salgado MT, Merrifield ME, Stillman MJ . 2006. Peptide folding, metal binding mechanism, and binding site structure in metallothionein. Society for experimental biology and medicine 1488- 1499. [FAO]. Food and Agriculture Organization of the United Nations IT. 2009. FAOSTAT database. [online]. http:faostat.fao.org. Framond de AJ. 1991. A metallothionein-like gene from maize Zea mays: cloning and characterization. FEBS Lett 290:103-106.doi:10.1016.0014- 57939181236-2 39 Fukuzawa H, Li-Hua Y, Umeda-Hara C, Tagawa M, Uchimiya H. 2004. The rice metallothionein gene promoter does not direct foreign gene expression in seed endosperm. Plant Cell Rep 23:231-235.doi:10.1007s00299-004-0813z Gelvin SB. 2003. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the “gene-jockeying” tool. Microbiol Mol Biol Rev 67:16-37.doi: 10.1128MMBR.67.1.16-37.2003 Guo WJ, Bundithya W, Goldsborough PB. 2003. Characterization of the Arabidopsis metallothionein gene family: tissue-specific expression and induction during senescence and in response to copper. New Phytol 159:369-381.doi:10.1046j.1469-8137.2003.00813.x Gunawan LW. 1992. Teknik kultur jaringan tumbuhan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi: Pusat Antar Universitas Bioteknologi. Bogor ID: Institut Pertanian Bogor. Grover A, Chandramouli A, Agarwal S, Katiyar-Agarwal S, Agarwal M, Sahi C . 2009. Abiotic stress tolerance in rice. Di dalam: Datta SK, editor. Rice improvement in the genomics era Chap ke-9. The United States of America US: CRC Press. hlm 237-242. Hall JL. 2001. Cellular mechanism for heavy metal detoxification and tolerance. J Exp Bot 53366:1-11.doi:10.1093jexbot53.366.1 Haq F, Mahoney M, Koropatnick J . 2003. Signaling events for metallothionein induction. Mutat Res 523:211–226. Harjadi SS, Yahya S. 1988. Fisiologi stres lingkungan. Pusat Antar Universitas Bioteknologi. Bogor ID: Institut Pertanian Bogor. Hiei Y, Ohta, S, Komari T, Kumashiro T. 1994. Efficient transformation of rice Oryza sativa L. mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J 6:271-282.doi: 10.1046j.1365- 313X.1994.6020271.x Hiei Y, Komari T. 2008. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols 35:824-834.doi:10.1038nprot.2008.46 Hong HP, Zhang H, Olhoft P, Hill S, Wiley H, Toren E, Hillebrand H, Jones T, Cheng M. 2007. Organogenic callus as the target for plant regeneration and transformation via Agrobacterium in soybean Glycine max L Merr In Vitro Cell Dev Biol Plant 43:558–568. Hoof van NALM, Hassinen VH, Hakvoort H, Ballintijn KF, Schat H. 2001. Enhanced copper tolerance in Silene vulgaris Moench garcke population from copper mines is associated with increased transcript levels of a 2b-type metallothionein gene. Plant Physiol 126 : 1519-1526. 40 Hsieh HM, Liu WK, Huang PC. 1995. A novel stress-inducible metallothionein- like gene from rice. Plant Mol Biol 28:381-389.doi:10.1007BF00020388 Hsieh HM, Liu WK, Chang A, Huang PC. 1996. RNA expression patterns of a type 2 metallothionein-like gene from rice. Plant Mol Biol 32:525-529.doi: 10.1007BF00019104 Huang GY, Wang YS. 2010. Expression and characterization analysis of type 2 metallothionein from grey mangrove species Avicennia marina in response to metal stress. Aquat Toxicol 99:86-92.doi:10.1016j.aquatox. 2010.04.004 [IRRI] International Rice Research Institute. 2008. The rice plant and how it grows. [terhubung berkala] http:www.knowledgebank.irri.org. [23 Juli 2011]. Jauhar PP. 2006. Modern biotechnology as an integral supplement to conventional plant breeding: The prospect and challenges. Crop Sci 46:1841-1859. doi:10.2135cropsci2005.07-0223 Jia DU, Jing-Li Y, Cheng-Hao LI. 2012. Advances in metallothionein studies in forest trees. POJ 51: 46-51.ISSN:1836-3644 Jin S, Cheng Y, Guan Q, Liu D, Takano T, Liu S. A metallothionein-like protein of rice rgMT functions in E. coli and its gene expression is induced by abiotic stress.Biotechnol Lett 28:1749-1753.doi:10.1007s10529-006-9152-1 Karthikeyan A, Pandian SK, Ramesh M. 2011. Agrobacterium-mediated transformation of leaf base derived callus tissues of popular indica rice Oryza sativa L. subsp. indica cv. ADT 43. Plant Sci 181:258-268.doi:10. 1016j.plantsci.2011.05.011 Kochian LV, Hoekenga OA, Pineros MA. 2004. How do crop plants tolerance acid soils? Mechanisme of aluminum tolerance and phosphorous efficiency. Annual Review of Plant Biology 55: 459-493.doi:10.1146annurev.arplant. 55.031903.141655 Kumar KK, Maruthasalam S, Loganathan M, Sudhakar D, Balasubramanian P. 2005. An improved Agrobacterium-mediated transformation protocol for recalcitrant elite indica rice cultivars. Plant Mol Biol Rep 23:67-73.doi: 10.1007BF02772648 Kyozuka J, Shimamoto K. 1991. Transformation and regeneration of rice protoplast. Di dalam: Lindsey K, editor. Plant Tissue Culture Manual: fundamental and applications Sec B. Netherlands NL: Kluwer Academic Publisher p:1-17. ISBN 0-7923-1115-9 Lee J, Shim D, Song WY, Hwang I, Lee Y. 2004. Arabidopsis metallothioneins 2a and 3 enhance resistance to cadmium when expressed in Vicia faba guard cells. Plant Mol Biol 54: 805–815.doi:10.1007s11103-004-0190-6 41 Li ZT, Gray DJ. 2005. Genetic engineering technologies. Di dalam: Trigiano RN, Gray DJ, editor. Plant development and biotechnology Chap 19. The United States of America US: CRC Press LLC. hlm 241-250. Lin YJ, Zhang Q. 2005. Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice. Plant Cell Rep 23:540-547.doi:10. 1007s00299-004-0843-6 McCullen CA, Binns AN. 2006. Agrobacterium tumefaciens and plant cell interactions and activities required for interkingdom macromolecular transfer. Annu Rev Cell Dev Biol 22:101-127.doi: 10.1146annurev.cellbio. 22.011105.102022 Miki B, McHugh S. 2003. Selectable marker genes in transgenic plants: applications, alternatives and biosafety. J Biotec 107:193-232.doi:10.1016 j.jbiotec.2003.10.011 Mohanty A, Sarma NP, Tyagi AK. 1999. Agrobacterium-mediated high frequency transformation of an elite indica rice variety Pusa Basmati 1 and transmission of the transgene to R2 progeny. Plant Science 147:127-137. doi:10.1016S0168-94529900103-X Nandakumar R, Babu S, Kalpana K, Raguchander T, Balasubramanian P, Samiyappan R. 2007. Agrobacterium-mediated transformation of indica rice with chitinase gene for enhanced sheath blight resistance. Biol Plant 51 1:142-148.doi: 10.1007s10535-007-0027-7 Nasir M. 2002. Bioteknologi molekular: teknik rekayasa genetik tanaman. Bandung ID: PT. Citra Aditya Bakti. Noor M. 1996. Padi lahan marjinal. Jakarta ID: PT. Penebar Swadaya. Palmiter RD. 2004. Protection against zinc toxicity by metallothionein and zinc transporter 1. Proc. Natl. Acad. Sci . 10114: 4918-4923.doi:10.1073pnas. 0401022101 Parmar P, Patel M, Dave B, Subramanian RB, Hyeun-jong B. 2012. Isolation, cloning and expression of novel metallothionein type II protein from Colocassia esculentum. Universal Journal of Medicine and Dentistry Vol 13: 037-045. Purnamaningsih R, Mariska I. 2008. Pengujian nomor-nomor harapan padi tahan Al dan pH rendah hasil seleksi in vitro dengan kultur hara. J. AgroBiogen 41: 18 −23. Rashid H, Yokoi S, Toriyama K, Hinata K. 1995. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice. Plant Cell Rep. 15: 727-730.doi: 10.1007BF00232216 42 Riva de la GA, Gonzalez-Cabrera J, Vazquenz-Padron R, Ayra-Pardo C. 1998. Agrobacterium tumefaciens: as natural tool for plant transformation. Electron J Biotechnol 13:118-133.doi: 10.2225vol1-issue3-fulltext-1 Robinson NJ, Tommey AM, Kuske C, Jackson PJ. 1993. Plant metallothionein. Biochem J 295:1-10. Robinson NJ, Wilson JR, Turner JS. 1996. Expression of the type 2 metaliothionein-like gene MT2 from Arabidopsis thaliana in Zn 2+ - metallothionein-deficient Synechococcus PCC 7942: putative role for MT2 in Zn 2+ metabolism. Plant Mol Biol 30: 1169-1179.doi:10.1007 bf00019550 Roslim DI. 2011. Isolasi dan karakterisasi gen toleran Aluminium dari tanaman padi [Disertasi]. Bogor ID: Institut Pertanian Bogor. Rout GR, Samantaray S, Das P. 2001. Aluminum toxicity in plants: a review. Agronomie 21: 3-21.doi: 10.1051agro:2001105 Sahoo KK, Tripathi AK, Pareek A, Sopory SK, Singla-Pareek SL. 2011. An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars. Plant Methods 7:49.doi:10.11861746-4811-7-49 Saika H, Toki S. 2010. Mature seed-derived callus of the model indica rice variety kasalath is highly competent in Agrobacterium-mediated transformation. Plant Cell Rep 29:1351-1364.doi:10.1007s00299-010-0921-x Salisbury BF, Ross CW. 1995. Plant Physiology 4th Ed. Utah US: Wadsworth Publishing. Siregar NAR. 2012. Transformasi genetik jatropa curcas dengan gen penyandi metallothionein tipe II dari Melastoma malabatricum L. MaMt2 menggunakan perantara Agrobacterium tumefaciens. Seminar Hasil Sekolah Program Pascasarjana, Bogor ID: Institut Pertanian Bogor. Skerritt JH. 2000. Genetically modified plants: developing countries and the public acceptance debate. Ag Biotech Net 2:1-8. Suharsono, Trisnaningrum N, Sulistyaningsih LD, Widyastuti U. 2009. Isolation and cloning of cDNA of gene encoding for metallothionein type 2 from Melastoma affine. Biotropia 161:28-37. Sutipradhit S, Edward DG, Asher CJ. 1990. Effect of aluminum root elongation of soybean Glycine max, cowpea Vigna anguiculata, mung green gram Vigna radiata grown in the presence of organic acid. Plant Soil 12412:169-174. Taylor HM. 1991. Root zone modification, fundamental and alternative. Di dalam Arkin GF, Taylor HM, editor. Modifying the Root Environmen to Reduce 43 Crop Stress. ONASE Monograph No. 4 in Series American Soc. Agric. Engineers. p.3-17. Tie W, Zhou F, Wang L, Xie W, Chen H, Li X, Lin Y. 2012. Reasons for lower transformation efficiency in indica rice using Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation: lessons from transformation assays and genome- wide expression profiling. Plant Mol Biol 78:1–18.doi:10.1007s11103-011- 9842-5 Toki S, Hara N, Ono K, Onodera H, Tagiri A, Oka S, Tanaka H. 2006. Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation of rice. Plant J 47:969-976.doi:10.1111j1365-313x.2006.02 836.x Trisnaningrum N. 2009. Analisis ekspresi gen penyandi metallothionein tipe II pada Melastoma affine L. yang mendapat cekaman pH rendah dan aluminium [Tesis]. Bogor ID: Institut Pertanian Bogor. Tzfira T, Citovsky V. 2006. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Curr Opin Plant Biotechnol 17:147-154. Usha B, Venkataraman G, Parida A. 2009. Heavy metal and abiotic stress inducible metallothionein isoforms from Prosopis juliflora SW D.C. show differences in binding to heavy metals in vitro. Mol Genet Genomics 281: 99-108.doi:10.1007s00438-008-0398-2 Vaughan DA, Morishima H. 2002. Biosystematics of the genus Oryza. Di dalam: Smith CW and Dilday RH, editor. Rice: origin, history, technology, and production Chap 1.2. The United States of America US: JohnWiley Sons Inc. hlm 27-65. Yang Z, Wu Y, Li Y, Ling HQ, Chu C. 2009. OsMT1a, a type 1 metallothionein, plays the pivotal role in zinc homeostasis and drought tolerance in rice. Plant Mol Biol 70:219–229.doi:10.1007s11103-009-9466-1 Zhang S, Song WY, Chen L, Ruan D, Taylor N, Ronald P, Beachy R, Fauquet C. 1998 . Transgenic elite indica rice varieties resistant to Xanthomonas oryzae pv.oryzae. Mol Breed 4: 551-558.doi:10.1023A:1009601520901 Zhou J, Goldsbrough PB. 1994. Functional homologs of fungal metallothionein genes from Arabidopsis. Plant Cell 6:875-884. Zhou GK, Xu YE, Liu JY. 2005. Characterization of a rice class II metallothionein gene: tissue expression patterns and induction in response to abiotic factors. J Plant Physiol 162:686-696.doi:10.1016j.jplph. 2004.11.006 Zhou GK, Xu YF, Li J, Yang L, Liu JY. 2006. Molecular analysis of the metallothionein gene family in rice Oryza sativa L.. J Biochem Mol Biol 39:595-606.doi:10.5483BMBRep.2006.39.5.595 44 Ziemienowicz A, Tzfira T, Hohn B. 2008. Mechanisms of T-DNA integration. Di dalam: Tzfira T, Citovsky V, editor. Agrobacterium: from biology to biotechnology Chap 11. New York US: Springer. Hlm 395-440. Wanichananan P, Teerakathiti T, Roytrakul S, Kirdmanee C, Peyachoknagul S. 2010. A highly efficient method for Agrobacterium mediated transformation in elite rice varieties Oryza sativa L. spp. indica. Afr J Biotechnol 34:5488-5495.doi:10.5897AJB10.327 Watanabe T, Misawa S, Hiradate S, Osaki M. 2008. Root mucilage enhances aluminum accumulation in Melastoma malabathricum, an aluminum accumulator. Plant Signal Behav 38:603-605. Wieczorex AM, Wright MG. 2012. History of agriculture biotechnology: How crop development has evolved. Nat Edu Knowledge 33:9. Wong HL, Sakamoto T, Kawasaki T, Umemura K, Shimamoto K. 2004. Down- regulation of metallothionein a reactive oxygen scavenger by the small GTPase OsRac1 in rice. Plant Physiol 135: 1447-1456.doi:10.1104 pp.103.036384 Winans SC. 1992. Two-way chemical signaling in Agrobacterium-plant interactions. Microbiol Rev 56:12-31. 45 Lampiran 1 Timeline dari Protocol Transformasi Hiei dan Komari 2008 46 Lampiran 2 Prosedur Pembuatan Media Induksi Kalus Komposisi Media Induksi Kalus 2N6 Untuk 1 Liter Bahan: 1. 10 x N6 Major Salt 100 ml 2. 100 x FeEDTA 10 ml 3. 100 x N6 Minor Salt 10 ml 4. 100 x N6 Vitamin 10 ml 5. 100 mg L -1 2,4-D 20 ml 6. Sukrosa 30 gr 7. Myo-inositol 0.1 gr 8. Prolin 0.5 gr 9. Vitamin Casamino Acid 0.5 gr 10. Gelrite 4 gr Cara pembuatan : Semua bahan dicampur tidak termasuk agar gelrite, dilarutkan dengan akuades sebanyak 700 ml selanjutnya ukur pH media hingga 5.8 dan cukupkan volume media hingga 1 liter dan tambahkan gelrite. Sterilisasi media dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit. Selanjutnya tuang media pada cawan petri, dan simpan dalam kondisi gelap suhu 25 ο C. Komposisi Larutan Stok 10 x N6 Major Salt Komposisi Jumlah g KNO 3 28. 3 NH 4 2 SO 4 4.63 CaCl 2 .2H 2 O 1.66 KH 2 PO 4 4.0 MgSO 4 .7H 2 O 1.85 Catatan: semua bahan dilarutkan dalam 1000 ml akuades simpan pada suhu 4 ο C. Komposisi Larutan Stok 100 x FeEDTA Komposisi Jumlah g FeSO 4 .7H 2 O 2.78 EDTA 3.73 Cara pembuatan : Bahan FeSO 4 .7H 2 O dilarutkan dalam akuades panas sebanyak 700 ml selanjutnya tambahkan 3.73 g EDTA, setelah suhu menurun menjadi 25 ο C cukupkan volume menjadi 1000 ml, dan simpan dalam kondisi gelap suhu 4 ο C. 47 Komposisi Larutan Stok 100 x N6 Minor Salt Komposisi Jumlah g MnSO 4 .4H 2 O 0.44 ZnSO 4 .7H 2 O 0.15 H 3 BO 3 0.16 KI 0.08 Catatan: semua bahan dilarutkan dalam 1000 ml akuades simpan pada suhu 4 ο C. Komposisi Larutan Stok 100 x N6 Vitamin Komposisi Jumlah g Thiamine hydrochloride 0.1 Pyridoxine hydrochloride 0.05 Nicotinic acid 0.05 Gly 0.2 Catatan: semua bahan dilarutkan dalam 1000 ml akuades simpan pada suhu 4 ο C. 48 Lampiran 3 Prosedur Pembuatan Media untuk A. tumifaciens Media AB plate Untuk 1 Liter Bahan: 1. Glukosa 5 gr 2. Agar Difco 15 gr Cara pembuatan : Larutkan glukosa dengan akuades steril sebanyak 800 ml, selanjutnya cukupkan volumenya menjadi 900 ml dan tambahkan agar. Sterilisasi media dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit. Selanjutnya dinginkan media hingga suhu sekitar 60 ο C, tambahkan 50 ml 20 x AB Salt, 50 ml 20 x AB buffer, dan antibiotiksesuai yang terdapat pada plasmid, tuang media pada cawan petri, dan simpan dalam kondisi gelap suhu 25 ο C. Komposisi larutan Stok 20 x AB Salt Komposisi Jumlah g NH 4 Cl 20 KCl 3 MgSO 4 .7H 2 O 6 CaCl 2 .2H 2 O 0.265 FeSO 4 .7H 2 O 0.05 Cara pembuatan : Semua bahan dicampur dan dilarutkan dengan akuades steril sebanyak 1000 ml, selanjutnya disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit dan simpan pada suhu 4 ο C. Komposisi larutan Stok 20 x AB Buffer Komposisi Jumlah g NaH 4 PO 4 20 K 2 HPO 4 60 Cara pembuatan : Semua bahan dicampur dan dilarutkan dengan akuades steril sebanyak 1000 ml, atur pH larutan pada pH 7.0 selanjutnya sterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit dan simpan pada suhu 4 ο C. 49 Lampiran 4 Prosedur Pembuatan Media Kokultivasi AAM Media Kokultivasi Untuk 1 Liter Bahan: 1. 20 x AA Major Salt 50 ml 2. 100 x FeEDTA 10 ml 3. 100 x B5 Minor Salt 10 ml 4. 100 x B5 Vitamin 10 ml 5. 10 x AA Amino Acid 100 ml 6. 100 mM Asetosiringon 1 ml 7. Sukrosa 68.5 gr 8. Glukosa 36 gr 9. Vitamin Casamino Acid 0.5 gr Cara pembuatan : Semua bahan dicampur dan dilarutkan dengan akuades steril sebanyak 1000 ml, selanjutnya disterilisasi dengan menggunakan dengan filter asetat sellulase 0.22 μm dan simpan pada suhu 4 ο C. Komposisi larutan Stok 20 x AA Major Salt Komposisi Jumlah g KCl 59 CaCl 2 .2H 2 O 3 MgSO 4 .7H 2 O 10 NaH 2 PO 4 .H 2 O 3 Catatan: semua bahan dilarutkan dalam 1000 ml akuades simpan pada suhu 4 ο C. Komposisi larutan Stok 100 x B5 Minor Salt Komposisi Jumlah g MnSO 4 .4H 2 O 1.32 ZnSO 4 .7H 2 O 0.2 CuSO 4 .5H 2 O 0.0025 Na 2 MoO 4 .2H 2 O 0.025 CoCl 2 .6H 2 O 0.0025 H 3 BO 3 0.3 KI 0.075 Catatan: semua bahan dilarutkan dalam 1000 ml akuades simpan pada suhu 4 ο C. 50 Komposisi larutan Stok 100 x B5 Vitamin Komposisi Jumlah g Myo-inositol 10 Thiamine hydrochloride 1 Pyridoxine hydrochloride 0.1 Nicotinic acid 0.1 Catatan: semua bahan dilarutkan dalam 1000 ml akuades simpan pada suhu 4 ο C. Komposisi larutan Stok 10 x AA Amino Acid Komposisi Jumlah g Gln 8.76 Asp 2.66 Arg 1.74 Gly 0.075 Cara pembuatan: Semua bahan dilarutkan dalam 1000 ml akuades steril, selanjutnya disterilisasi dengan filter asetat sellulase 0.22 μm dan disimpan pada suhu 4 ο C. 51 Lampiran 5 Prosedur Pembuatan Media Kokultivasi 2N6-As Komposisi Media Kokultivasi Untuk 1 Liter Bahan: 1. 10 x N6 Major Salt 100 ml 2. 100 x FeEDTA 10 ml 3. 100 x N6 Minor Salt 10 ml 4. 100 x N6 Vitamin 10 ml 5. 100 mg L -1 2,4-D 20 ml 6. Sukrosa 20 gr 7. Glukosa 10 gr 8. Vitamin Casamino Acid 0.5 gr 9. Gelrite 4 gr Cara pembuatan : Semua bahan tidak termasuk agar gelrite dilarutkan dengan akuades sebanyak 700 ml selanjutnya ukur pH media hingga 5.2 dan cukupkan volume media hingga 1 liter dan tambahkan gelrite. Sterilisasi media dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit. Selanjutnya dinginkan media hingga suhu sekitar 50 ο C dan tambahkan 1 ml 100 mM Asetosiringon, tuang media pada cawan petri, dan simpan dalam kondisi gelap suhu 25 ο C. 52 Lampiran 6 Prosedur Pembuatan Media Seleksi I Komposisi Media Seleksi 2NBKCH20 Untuk 1 Liter Bahan: 1. 10 x N6K Major Salt 100 ml 2. 100 x FeEDTA 10 ml 3. 100 x B5 Minor Salt 10 ml 4. 100 x B5 Vitamin 10 ml 5. 100 mg L -1 2,4-D 20 ml 6. Maltosa 30 gr 7. Myo-inositol 0.1 gr 8. Prolin 0.5 gr 9. Vitamin Casamino Acid 0.5 gr 10. Gelrite 4 gr Cara pembuatan : Semua bahan tidak termasuk agar gelrite dilarutkan dengan akuades sebanyak 700 ml selanjutnya ukur pH media hingga 5.8 dan cukupkan volume media hingga 1 liter dan tambahkan gelrite. Sterilisasi media dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit. Selanjutnya dinginkan media hingga suhu sekitar 60 ο C dan tambahkan 100 ml 10 x AA amino acid pH 5.8, 0.4 ml 50 mg L -1 higromisin konsentrasi akhir 20 mg L -1 , 1 ml 250 g L -1 cefotaxime dan 0.4 ml 250 g L -1 carbenicilin, tuang media pada cawan petri, dan simpan dalam kondisi gelap suhu 25 ο C. Komposisi larutan Stok 10 x N6K Major Salt Komposisi Jumlah g KNO 3 20.22 CaCl 2 .2H 2 O 1.66 MgSO 4 .7H 2 O 1.85 KH 2 PO 4 4.0 Catatan: semua bahan dilarutkan dalam 1000 ml akuades simpan pada suhu 4 ο C. 53 Lampiran 7 Prosedur Pembuatan Media Seleksi II Komposisi Media Seleksi nN6CH30 Untuk 1 Liter Bahan: 1. 10 x N6 Major Salt 100 ml 2. 100 x FeEDTA 10 ml 3. 100 x N6 Minor Salt 10 ml 4. 100 x N6 Vitamin 10 ml 5. 100 mg L -1 2,4-D 10 ml 6. 100 mg L -1 NAA 5 ml 7. 100 mg L -1 6BA 1 ml 8. Sukrosa 20 gr 9. Sarbitol 55 gr 10. Prolin 0.5 gr 11. Vitamin Casamino Acid 0.5 gr 12. Gelrite 5 gr Cara pembuatan : Semua bahan tidak termasuk agar gelrite, dilarutkan dengan akuades sebanyak 700 ml selanjutnya ukur pH media hingga 5.8 dan cukupkan volume media hingga 1 liter dan tambahkan gelrite. Sterilisasi media dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit. Selanjutnya dinginkan media hingga suhu sekitar 50 ο C dan tambahkan, 0.6 ml 50 mg L -1 higromisin konsentrasi akhir 30 mg L -1 , 1 ml 250 g L -1 cefotaxime dan 0.4 ml 250 g L -1 carbenicilin, tuang media pada cawan petri, dan simpan dalam kondisi gelap suhu 25 ο C. 54 Lampiran 8 Prosedur Pembuatan Media Regenerasi Komposisi Media Regenerasi 2N6R Untuk 1 Liter Bahan: 1. 10 x N6 Major Salt 50 ml 2. 100 x FeEDTA 10 ml 3. 100 x N6 Minor Salt 10 ml 4. 100 x N6 Vitamin 10 ml 5. 100 mg L -1 Kinetin 5 ml 6. Sukrosa 20 gr 7. Sarbitol 30 gr 8. Vitamin Casamino Acid 1 gr 9. Gelrite 4 gr Cara pembuatan : Semua bahan dicampur tidak termasuk agar gelrite, dilarutkan dengan akuades sebanyak 700 ml selanjutnya ukur pH media hingga 5.8 dan cukupkan volume media hingga 1 liter dan tambahkan gelrite. Sterilisasi media dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit. Selanjutnya dinginkan media hingga suhu sekitar 60 ο C dan tambahkan 100 ml 10 x AA amino acid pH-free, tuang media pada cawan petri, dan simpan dalam kondisi gelap suhu 25 ο C. 55 Lampiran 9 Prosedur Pembuatan Media Pengakaran Komposisi Media Pengakaran 2N6F Untuk 1 Liter Bahan: 1. 10 x N6 Major Salt 50 ml 2. 100 x FeEDTA 10 ml 3. 100 x N6 Minor Salt 10 ml 4. 100 x N6 Vitamin 10 ml 5. Sukrosa 15 gr 6. Sarbitol 30 gr 7. Vitamin Casamino Acid 1 gr 8. Gelrite 3 gr Cara pembuatan : Semua bahan dicampur tidak termasuk agar gelrite, dilarutkan dengan akuades sebanyak 700 ml selanjutnya ukur pH media hingga 5.8 dan cukupkan volume media hingga 1 liter dan tambahkan gelrite. Sterilisasi media dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit. Selanjutnya dinginkan media hingga suhu sekitar 60 ο C dan tambahkan 100 ml 10 x AA amino acid pH 5.8, tuang media pada cawan petri, dan simpan dalam kondisi gelap suhu 25 ο C. Komposisi larutan Stok 10 x AA Amino Acid pH 5.8 Komposisi Jumlah g Gln 8.76 Asp 2.66 Arg 1.74 Gly 0.075 Cara pembuatan: Semua bahan dilarutkan dalam 1000 ml akuades steril dan atur pH menjadi 5.8, selanjutnya disterilisasi dengan filter asetat sellulase 0.22 μm dan disimpan pada suhu 4 ο C. 56 Lampiran 10 Penentuan Efisiensi Transformasi Efisiensi Transformasi = . × 100 Lampiran 11 Penentuan Frekuensi Regenerasi Frekuensi Regenerasi = × 100 1 1 PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Pada periode 10 tahun terakhir jumlah penduduk Indonesia meningkat dengan laju pertumbuhan per tahun sekitar 1,49 persen. Berdasarkan sensus penduduk tahun 2010, penduduk Indonesia mencapai 237.641.326 jiwa BPS 2011, ini mengakibatkan meningkatnya permintaan pangan. Padi merupakan salah satu tanaman pangan sangat penting, yang dikonsumsi oleh hampir 80 penduduk dunia terutama di Asia. Indonesia memiliki konsumsi beras yang mencapai 139 kg per orang per tahun, di atas rata-rata konsumsi beras dunia yaitu sebesar 60 kg per orang per tahun FAO 2009. Sementara itu, produksi padi Indonesia tahun 2011 mengalami penurunan sebesar 65,39 juta ton Gabah Kering Giling GKG, atau turun sebanyak 1,08 juta ton beras 1,63 persen dibandingkan tahun 2010. Penurunan produksi diperkirakan terjadi karena penurunan luas panen yaitu 29,07 ribu hektar 0,22 BPS 2011. Menurut Grover et al. 2009, beberapa faktor yang menyebabkan penurunan produksi padi di Indonesia adalah periode musim kemarau yang panjang dan terendamnya 10 lahan pertanian pada musim penghujan. Cekaman abiotik merupakan salah satu penyebab penurunan produksi padi, karena tanaman padi sangat peka terhadap cekaman abiotik. Beberapa cekaman abiotik antara lain adalah kekeringan, salinitas, suhu yang ekstrim, ion-ion toksik, kelebihan air, polusi udara, angin, pasir dan tanah padat Harjadi dan Yahya 1988. Cekaman abiotik ini menyebabkan timbulnya cekaman oksidatif pada tanaman yang berakibat produksi berlebih dari spesies oksigen radikal ROS, yang dapat menyebabkan kerusakan sel dan kematian pada tanaman. Untuk meningkatkan produksi nasional, perakitan varietas padi yang dapat beradaptasi pada lingkungan yang kurang menguntungkan seperti cekaman abiotik sangat diperlukan. Varietas yang toleran terhadap cekaman abiotik dapat digunakan untuk memperluas areal tanam. Upaya pengembangan varietas-varietas yang mempunyai daya adaptasi tinggi terhadap lingkungan , dapat dilakukan dengan pemuliaan tanaman yang salah satunya adalah dengan bioteknologi. Penggunaan bioteknologi m elalui introduksi gen-gen yang berperan dalam ketahanan terhadap cekaman lingkungan abiotic stress diharapkan akan diperoleh varietas-varietas yang toleran , terutama toleransi terhadap cekaman abiotik sehingga dapat mempertinggi produksi tanaman budidaya di lahan marginal. Untuk merakit varietas yang baru dengan mengintroduksikan gen diperlukan sumber gen, salah satu sumber gen untuk toleransi terhadap cekaman lingkungan adalah Melastoma malabathricum L. atau Melastoma affine L. Tanaman Melastoma malabathricum L. merupakan tanaman semak gulma tidak bernilai ekonomi, asli Asia Tenggara yang toleran terhadap cekaman aluminium Al pada tanah masam. Gen-gen yang ekspresinya diinduksi oleh aluminium, pada tanaman ini diduga terlibat dalam sistem toleransi terhadap Al. Ekspresi gen MaMt2 diakar meningkat pada Melastoma malabathricum L. yang mendapat cekaman 3.2 mM Al pada pH 4 dibandingkan dengan tanaman yang tidak mendapat cekaman Al Trisnaningrum 2009. Gen MaMt2 adalah g en penyandi 2 metallothionein tipe II yang telah diisolasi dari tanaman Melastoma affine L. Suharsono et al. 2009. Gen MaMt2 ini telah difusikan dengan promoter ubiquitin di dalam plasmid pIG6 dan telah diintroduksi ke dalam tanaman kedelai Anggraito et al. 2012. Gen Metallothionein telah diisolasi dari berbagai spesies tanaman seperti Arabidopsis Zhou dan Goldsbrough 1994, jagung Framond de 1991, padi Fukuzawa et al. 2004; Jin et al. 2006; Zhou et al. 2006, dan Melastoma affine L. Suharsono et al. 2009. Metallothionein adalah salah satu protein yang berperan dalam toleransi terhadap logam-logam berbahaya, homeostatis logam, detokfikasi logam berat. Pada kondisi lingkungan normal MT berperan dalam penyimpanan dan mobilisasi logam esensial seperti Cu dan Zn Hall 2001. Metallothionein MT adalah protein yang banyak mengandung sistein yang berfungsi mengikat logam metal binding peptides. Klasifikasi metallothionein pertama kali diperkenalkan oleh Robinson et al. 1993 yang membagi metallothionein ke dalam dua kategori yaitu tipe 1 dan 2, selanjutnya klasifikasi ini diperbarui oleh Cobbett dan Goldbrough 2002, menjadi empat kategori yaitu tipe 1, 2, 3, dan 4. Klasifikasi ini disusun berdasarkan sekuen asam aminonya, Menurut Duncan et al. 2006, motif dan susunan residu sistein Cys yang dimiliki oleh metallothionein MT diduga berkaitan dengan kemampuan MT mengikat logam dan kestabilan protein. Beberapa penelitian telah dilakukan untuk menganalisis ekspresi Metallothionein MT yaitu pada tanaman Silene vulgaris Hoof van et al. 2001, Arabidopsis Zhou dan Goldsbrough 1994; Guo et al. 2003, padi Zhou et al. 2005; Hsieh et al. 1996 dan Melastoma affine L. Trisnaningrum 2009. Ekspresi Metallothionein MT pada tanaman sebagian besar diinduksi oleh logam berat seperti tembaga Cu, seng Zn, cadmium Cd, dan aluminium Al Cousins et al. 1983; Hall 2001. Introduksi gen penyandi metallotionein tipe II dari Melastoma malabathricum L. MaMt2 melalui transformasi genetik ke dalam tanaman pertanian seperti padi diharapkan dapat menghasilkan tanaman yang memiliki ketahanan terhadap ion-ion logam toksik .

1.2. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengintroduksi gen MaMt2 yang diisolasi dari tanaman Melastoma affine L. dibawah kendali promoter ubiquitin ke dalam genom tanaman padi Oryza sativa L. kultivar Kasalath dan Nipponbare melalui perantara Agrobacterium tumefaciens.