Metallothionein Genetic transformation of rice (Oryza sativa L.) with gene encoding Melastoma malabathricum metallothionein type II (MaMt2) using Agrobacterium tumefaciens-mediated transfer.

9 yang diperoleh menunjukkan bahwa degradasi metallothionein dipengaruhi ikatan logam. Konsep ini juga diperkuat melalui eksperimen degradasi secara in vitro, yaitu pelabelan seng dan kadmium yang menginduksi metallothionein, selanjutnya metallothionein diisolasi dan diinkubasi dengan protease. Protease mendegradasi protein metallothionein. Protein metallothionein kadmium lebih resisten dibandingkan protein metallothionein seng Cousins 1983. Degradasi metallothionein tembaga berlangsung dengan cepat pada kondisi in vivo. Aspek utama dari sintesis dan degradasi metallothionein ditunjukkan pada Gambar 2 Cousins 1983. Gambar 2 Mekanisme sellular yang mempengaruhi sintesis dan degradasi metallothionein Cousins et al. 1983 Fungsi dari metallothionein menurut Cousins 1983 adalah sebagai berikut: 1 metallothionein memiliki peranan yang penting dalam metabolisme sellular, 2 metallothionein merupakan suatu ligan penyangga untuk menetralkan atau menghilangkan pengaruh logam-logam toksik dan 3 metallothionein merupakan kelompok sulfur yang terlibat dalam oksidasi-reduksi dan terkait erat dengan pengikatan logam. Metallothionein juga memiliki kemampuan sebagai antioksidan Robinson et al. 1993. Kerusakan DNA yang diakibatkan oleh cekaman oksidatif mengalami penurunan dengan meningkatnya level metallothionein. Selama tiga dekade berikutnya, protein metallothionein telah berhasil diidentifikasi pada semua makhluk hidup, termasuk hewan, cyanobacteria, fungi, dan tanaman tingkat tinggi Cobbett dan Goldsbrough 2002. Struktur yang mirip metallothionein pada protein tanaman pertama kali diidentifikasi pada protein E c gandum dan gen yang menyandi protein mirip 10 metallothionein ini berhasil diisolasi oleh Kawashima pada tahun 1992, gen ini terletak dikromosom gandum hexaploid 1A, 1B dan 1D Robinson et al. 1993. Protein metallothionein dari beberapa spesies tanaman ditunjukkan pada Gambar 3. Posisi residu sistein dengan motif khusus Cys-Xaa-Cys menunjukkan bahwa protein ini memiliki kemampuan mengikat ion logam, sehingga protein ini memiliki peranan dalam metabolisme logam Robinson et al. 1993. Gambar 3 Urutan asam amino metallothionein dari tanaman yang memiliki kesamaan dengan protein E c . Distribusi residu sistein -ditandai dengan warna merah- Robinson et al. 1993. Berdasarkan posisi residu sistein protein metallothionein dikelompokkan menjadi dua tipe yaitu tipe 1 dan 2 Gambar 3. Tipe 1 memiliki motif Cys-Xaa- Cys sedangkan pada tipe 2 memiliki motif Cys-Cys dan sepasang Cys-Xaa-Xaa- Cys dalam domain N-terminal Robinson et al. 1993. Klasifikasi protein metallothionein disusun berdasarkan susunan residu asam amino sistein, yang sebagian besar residu sistein dalam metallothionein akan membentuk suatu mercaptide dengan sejumlah logam. Hal ini dikarenakan sistein memiliki komposisi organosulfur yaitu group karbon yang berikatan dengan sulfurhidroksil C-SH atau R-SH disebut juga thiol, yang memiliki afinitas sulfur tinggi yang dapat mengikat ion logam toksik. Gugus thiol ini sangat penting pada proses biologi seperti pembentukan protein melalui ikatan disulfida, struktur protein tersier dan kuarter dan mekanisme terhadap ion logam berat. Menurut Cobbet dan Goldsbrough 2002, protein metallothionein pada tanaman terbagi ke dalam empat kategori berdasarkan sekuen asam aminonya. Untuk tipe 1 dan 2 mengikuti klasifikasi Robinson et al. 1993, sedangkan metallothionein tipe 3 diekspresikan pada saat pematangan buah, dan tipe 4 sebagai contoh adalah protein Ec pada gandum. 11 Metallothionein tipe 1 tersusun dari enam motif Cys-Xaa-Cys dimana Xaa adalah asam amino lain, yang terdistribusi secara merata dalam dua domain. Kebanyakan metallothionein tipe 1, terdiri dari dua domain dipisahkan oleh ± 40 asam amino termasuk asam amino aromatik, namun terdapat juga domain kaya sistein yang dipisahkan ± 10 asam amino, yang tidak termasuk residu aromatik dalam MT tipe 1 dari beberapa Brassicaceae Cobbet dan Goldsbrough 2002. Metallothionein tipe 2 terdiri dari dua domain yang dipisahkan oleh ± 40 residu asam amino, pada pasangan sistein pertama terdapat motif Cys-Cys pada asam amino posisi 3 dan 4 dari protein ini. Motif Cys-Gly-Gly-Cys terdapat di ujung dari N terminal domain yang kaya sistein. Untuk metallothionein tipe 3, hanya terdiri dari empat residu sistein pada domain N terminal. Konsensus untuk tiga sistein pertama memiliki motif Cys-Gly-Asn-Cys-Asp-Cys. Sedangkan sistein yang tipe 4 memiliki motif yaitu Gln-Cys-Xaa-Lys-Lys-Gly. Metallothionein tipe 4 berbeda dengan metallothionein tipe yang lain, yaitu memiliki tiga domain kaya sistein, masing-masing memiliki 5 atau 6 residu sistein yang terkonservasi Cobbet dan Goldsbrough 2002. Isolasi dan pengklonan gen-gen mengkode protein metallothionein telah dilakukan sejak lama, pertama kali dilakukan oleh Miranda et al. tahun 1990 pada tanaman Mimulus guttatus dan jagung Framond 1991. Semua gen yang mengkodekan protein ini memiliki dua domain yang kaya sistein dengan motif Cys-Xaa-Cys dimana Xaa adalah asam amino selain sistein Robinson et al. 1993. Sampai saat ini isolasi dan pengklonan gen penyandi metallothionein masih terus berlangsung, untuk kelompok Angiospermae termasuk Arabidopsis, padi dan tebu memiliki keempat tipe dari gen metallothionein Cobbet dan Goldsbrough 2002, Helianthus tuberosus Chang et al. 2002, Prosopis juliflora Usha et al. 2009 dan Colocassia esculentum Parmar et al. 2012. Studi detail pada tanaman menunjukkan bahwa fungsi protein metallothionein tidak saja pada metabolisme dan detoksifikasi logam Hall 2001; Cobbett dan Goldsbrough 2002 tetapi juga ikut terlibat dalam berbagai proses biologi seperti apotosis, pertumbuhan, perkembangan embrio, perkembangan mikrospora, senessense, pematangan, perkembangan buah dan respon terhadap stres Cobbett dan Goldsbrough 2002; Lee et al. 2004; Ahn et al. 2011; Jia et al. 2012, selain itu berperan dalam pertumbuhan sel, proliferasi sel, aktivitas metalloenzim dan faktor transkripsi Palmiter 2004; Haq et al. 2003, dan merupakan scavenger spesies oksigen reaktif ROS Wong et al. 2004. Informasi mengenai ekspresi gen metallothionein pada berbagai tanaman ditunjukkan pada Tabel 3. Analisis pola ekspresi dapat membantu untuk mengungkapkan kemungkinan fungsi biologi dari gen Metallothionein, misalnya gen Metallothionein pada gandum Ec dan barley diekspresikan pada tahap perkembangan benih, sedangkan metallothionein pada kedelai diekspresikan lebih kuat pada daun dibandingkan di bagian akar. Untuk pea, Mimulus, dan jagung diekspresikan pada perkembangan akar Robinson et al. 1993. Ekspresi gen Metallothionein pada tanaman diregulasi oleh berbagai faktor antara lain: ion-ion logam, cekaman abiotik antara lain: cekaman osmotik, temperatur rendah, heat shock, serta serangan patogen Hsieh et al. 1996; Wong et al. 2004; Jin et al. 2006; Usha et al. 2009; Jia et al. 2012. Mekanisme metallothionein pada tanaman ditunjukkan pada Gambar 4 Jia et al. 2012. 12 Famili gen Metallothionein juga terdapat pada padi. Hsieh et al. 1995 berhasil mengisolasi gen metallothionein dari pustaka genom Oryza sativa. Gen metallothionein yang terdiri dari 2 ekson dan 1 intron. Protein yang disandikan oleh gen ini terdiri dari 72 asam amino yang terinduksi oleh cekaman pengurangan sukrosa dan tembaga. Metallothionein terekspresi kuat diberbagai organ padi. Gen OsMT1 dan OsMT2 telah isolasi dari cDNA metallothionein. Peran gen OsMT2 lebih kompleks dibandingkan OsMT1 yaitu berperan dalam respon sel terhadap berbagai cekaman, OsMT2 terekspresi oleh cekaman sukrosa, heat shock, dan asam abscisic, sedangkan OsMT1 terinduksi oleh logam tembaga Hsieh et al. 1996. Tabel 3 Ekspresi gen metallothionein pada beberapa tanaman Robinson et al.1993 Gambar 4 Model mekanisme aksi metallothionein pada tanaman Jia et al. 2012 Gen OsMT2b berperan menangkap spesies oksigen reaktif reactive oxygen spesies dan homeostatis logam, regulasi ekspresi gen OsMT2b secara sinergis oleh OsRac1 dapat mengurangi serangan blast pada tanaman padi Wong et al. 2004. Fukuzawa et al. 2004 telah mengisolasi gen Metallothionein tipe 4 ricMT dari padi yang terekspresi kuat di batang, promotor ricMT terekspresi sangat kuat pada tanaman transgenik kecuali di endosperm. 13 Lengkapnya analisis sekuen genom padi dengan keterangan 37500 gen yang menjadi fokus perhatian pada analisis molekular berasal dari famili gen MT Zhou et al. 2006. Analisis yang menyeluruh dari sekuen genom padi menunjukkan ada 11 gen yang menyandikan metallothionein padi OsMt, ini mengindikasikan bahwa OsMt merupakan famili gen pada genom padi. Famili gen MT padi diklasifikasikan kedalam dua kelas, kelas satu dibagi kedalam empat tipe yang berdasarkan kemiripan skuen dan hubungan filogenetik, sedangkan kelas dua berdasarkan pola susunan residu sistein, gen Metallothionein pada padi ditunjukkan pada Tabel 4. Ekspresi dari tiap gen dalam famili gen OsMt memperlihatkan perbedaan, tidak hanya pada sekuennya tetapi juga pada pola ekspresi dari jaringannya Zhou et al. 2006. Tabel 4 Gen Metallothionein pada padi Zhou et al. 2006 a nomor aksesi GenBank untuk setiap gen; b mengindikasikan lokasi dari posisi nukleotida pertama dan terakhir untuk setiap gen dalam kromosom; c tanda kurung menunjukkan nama sebelumnya; tanda bintang menunjukkan metallothionein baru dari pencarian database. Saat ini, gen Metallothionein telah banyak diisolasi dari berbagai jenis tanaman dan diekspresikan didalam berbagai jaringan maupun organ seperti pada akar, batang, daun, biji, dan buah dari berbagai spesies tanaman yang berbeda, ini bertujuan untuk meningkatkan nilai suatu tanaman, terutama tanaman budidaya. Gen Metallothionein dari berbagai organisme dengan bentuk yang sesuai dengan asosiasi ion-ion logam telah diekspresikan dalam E. coli dan yeast Lee et al. 2004, Arabidopsis t. Robinson et al.1996; Guo et al. 2003; Ahn et al. 2011, Nicotiana benthamiana Anggraito et al. 2012, Avicennia mariana Huang dan Wang 2010, padi Fukuzawa et al. 2004; Wong et al. 2004; Yang et al. 2009, kedelai Anggraito 2012 dan jatropa Siregar 2012. Gen MaMt2 adalah gen penyandi metallothionein tipe 2 yang diisolasi dari tanaman Melastoma Malabathricum L dan berhasil diklon oleh Suharsono et al. 2009. Gen ini diduga memiliki sifat toleransi terhadap toksisitas aluminium pada tanah masam, hal ini berdasarkan kemampuan tanaman Melastoma affine sekarang bernama Melastoma malabathricum L. dalam mengakumulasi Al. Tanaman ini dapat bertahan pada cekaman Al dengan konsentrasi Al 3,2 mM Trisnaningrum 2009. Gen ini terdiri dari 246 pb dan mengkode 81 asam amino, dan memiliki 14 residu sistein dengan motif Cys-Cys, Cys-X-Cys, dan Cys-X-X- Cys Suharsono et al. 2008, gen ini telah difusikan dengan promotor ubiquitin Anggraito et al. 2012. 14

2.4 Transformasi Genetik Padi

Transformasi genetik adalah proses introduksi gen dari satu organisme ke organisme lain yang memungkinkan untuk memunculkan sifat harapan tanpa mengubah sifat lain. Transformasi pertama kali ditemukan oleh Frederick Griffith pada tahun 1928, sedangkan transformasi genetik tanaman adalah pengubahan genetik tanaman melalui transfer DNA eksogen yang berasal dari spesies yang berbeda yang disertai ekspresi DNA tersebut ke dalam genom tanaman target Skerritt 2000. Menurut Birch 1997 transformasi genetik pada tanaman dilakukan sebagai alat eksperimen untuk mempelajari fisiologi tanaman, dan untuk pemuliaan tanaman. Pemuliaan tanaman umumnya ditentukan oleh sistem reproduksi tanaman, apakah menyerbuk sendiri atau silang. Tanaman menyerbuk sendiri cenderung melakukan peristiwa silang dalam inbreeding yang menghasilkan homozigositas dan stabilitas genetik, dari segi kepentingan tanaman menyerbuk sendiri dipertahankan sebagai populasi homozigot dan menghasilkan keturunannya yang sama atau mendekati tetuanya. Sebaliknya tanaman menyerbuk silang merupakan pelaku silang luar outbreeding dan dipertahankan dalam populasi heterozigot dan heterogen, dimana setiap tanaman dapat saling berbeda satu sama lain dalam satu populasi, keturunannya cenderung berbeda dengan tetuanya. Pemuliaan tanaman secara konvensional memiliki beberapa kendala, antara lain: 1 terbatasnya persediaan sumber gen baru, karena harus bersumber dari spesies atau genus yang sama, 2 sulitnya melakukan persilangan antara dua genera yang berbeda, karena adanya faktor sterilitas dan inkompatibilitas, dan 3 biasanya memerlukan waktu, biaya dan tenaga yang relatif sangat besar Nasir 2002. Alternatif untuk mengatasi kendala ini adalah dengan menggunakan rekayasa genetik melalui transformasi genetik. Pemuliaan tanaman melalui transformasi genetik memiliki keunggulan antara lain : 1 dengan transformasi genetik memungkinkan gen penyandi sifat tertentu dipilih secara spesifik dan ditransfer ke tanaman target, 2 memungkinkan introduksi gen dari tanaman atau organisme lain yang tidak berkerabat tanpa terkendala oleh kompatibilitas seksual dalam persilangan, sehingga menghemat waktu dan mengurangi peluang ikutnya sifat-sifat yang tak diinginkan pada tanaman yang ditransformasi Jauhar 2006; Wieczorek dan Wright 2012. Ekspresi gen yang akan ditransfer ke tanaman target dapat dimodifikasi melalui perakitan gen dengan komponen promotor dan elemen pemacu enhancer tertentu. Fukuzawa et al. 2004 menggunakan promotor kuat untuk ekspresi gen Metallothionein pada tanaman tembakau dan padi, dimana gen Metallothionein terekspresi kuat pada batang dan akar tetapi tidak pada endosperma. Komponen dasar dan penting untuk menghasilkan tanaman transgenik antara lain: 1 ketersediaan jaringan target meliputi sel-sel yang kompeten untuk transformasi dan beregenerasi, 2 metode introduksi DNA ke dalam sel-sel akan beregenerasi, dan 3 prosedur seleksi dan regenerasi tanaman transforman Birch 1997. Transformasi genetik pada padi dapat dilakukan dengan berbagai metode, diantaranya elektroporasi, perlakukan PEG, bombardemen proyektil mikro dan Agrobacterium tumifaciens Ashikari et al. 2004. Transformasi genetik tanaman yang dimediasi oleh Agrobacterium tumefaciens telah menjadi metode yang 15 paling popular untuk mengintroduksi gen asing ke dalam sel tanaman padi dan regenerasi dari tanaman transgenik. Transfer gen dengan perantara Agrobacterium tumefaciens adalah metode yang paling efektif, karena memberikan efisiensi transformasi yang tinggi, dapat digunakan untuk transgen berukuran besar dan cenderung menghasilkan integrasi salinan tunggal transgen pada genom tanaman padi Hiei dan Komari 2008. Secara alami Agrobacterium tumefaciens hanya menginfeksi tanaman dikotil dan menunjukkan efisiensi transformasi yang rendah pada tanaman monokotil seperti padi, namun seiring berjalan waktu dan banyaknya penelitian yang dilakukan untuk meningkatkan efisiensi transformasi pada tanaman monokotil. Saat ini, transformasi genetik menggunakan perantara Agrobacterium tumefaciens menjadi sangat popular dibandingkan teknik yang lain, terutama pada tanaman padi. Berdasarkan penelitian singkat, dari ± 300 paper jurnal yang dipilih secara acak menunjukkan 80 lebih menggunakan Agrobacterium tumefaciens sebagai alat untuk transfer gen. Hiei et al. 1994 menjadi pelopor teknik transformasi genetik padi yang menggunakan perantara bakteri Agrobacterium tumefaciens. Sejumlah besar tanaman padi transgenik telah dihasilkan dengan menggunakan perantara Agrobacterium tumefaciens sebagai vektor untuk mentransfer gen Hiei et al. 1994; Rashid et al. 1995; Kumar et al. 2005; Toki et al. 2006; Nandakumar et al. 2007; Hiei dan Komari 2008; Saika dan Toki 2010. Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri tanah golongan gram negatif, dengan suhu optimal pertumbuhan bakteri adalah 28-30 o C. Bakteri ini bersifat fitopatogen karena dapat membentuk tumor crown gall pada sel tanaman, mampu menginfeksi sejumlah besar tanaman dikotil dan sejumlah kecil tanaman monokotil. Pembentukan tumor adalah hasil transfer, integrasi dan ekspresi gen dari segmen spesifik yang disebut T-DNA transfered-DNA, terdapat pada plasmid Ti tumor inducing. Mekanisme transfer gen oleh Agrobacterium tumefaciens ke sel inang host dengan jalan memindahkan segmen T-DNA dari plasmid Ti ke dalam genom tanaman inang. Proses transformasi genetik tanaman dengan perantara bakteri Agrobacterium tumefaciens, terdiri dari 10 tahap utama yaitu: 1 pengenalan dan perlekatan Agrobacterium tumefaciens pada sel inang, yang diikuti dengan 2 penginderaan sinyal tanaman yang spesifik oleh dua komponen sistem tranduksi signal pada Agrobacterium tumefaciens yaitu VirA atau VirG, 3 ekspresi daerah vir yang menghasilkan protein-protein vir yang memulai proses transfer T-DNA, 4 salinan T-DNA yang akan ditransfer ke tanaman diproduksi oleh kerja protein VirD1VirD2, bersama-sama dengan beberapa protein Vir lainnya kedalam sitoplasma sel inang, 6 Vir E2 berasosiasi dengan utas T-DNA dan bergerak menuju sitoplasma sel inang, 7 kompleks T-DNA masuk ke dalam inti sel inang melalui proses impor aktif, 8 setelah berada dalam inti sel, T-DNA menuju tempat integrasi DNA pada kromosom, 9 protein-protein pengawal DNA terlepas dan 10 DNA terintegrasi ke dalam genom sel inang, Gambar 5 Tzfira dan Citovsky 2006.