Metallothionein Genetic transformation of rice (Oryza sativa L.) with gene encoding Melastoma malabathricum metallothionein type II (MaMt2) using Agrobacterium tumefaciens-mediated transfer.
9
yang diperoleh menunjukkan bahwa degradasi metallothionein dipengaruhi ikatan logam. Konsep ini juga diperkuat melalui eksperimen degradasi secara in vitro,
yaitu pelabelan
seng dan
kadmium yang
menginduksi metallothionein,
selanjutnya metallothionein diisolasi dan diinkubasi dengan protease. Protease mendegradasi protein metallothionein. Protein metallothionein kadmium lebih
resisten dibandingkan protein metallothionein seng Cousins 1983. Degradasi metallothionein tembaga berlangsung dengan cepat pada kondisi in vivo. Aspek
utama dari sintesis dan degradasi metallothionein ditunjukkan pada Gambar 2 Cousins 1983.
Gambar 2 Mekanisme sellular yang mempengaruhi sintesis dan degradasi metallothionein Cousins et al. 1983
Fungsi dari metallothionein menurut Cousins 1983 adalah sebagai berikut: 1 metallothionein memiliki peranan yang penting dalam metabolisme sellular, 2
metallothionein merupakan suatu ligan penyangga untuk menetralkan atau menghilangkan pengaruh logam-logam toksik dan 3 metallothionein merupakan
kelompok sulfur yang terlibat dalam oksidasi-reduksi dan terkait erat dengan pengikatan logam.
Metallothionein juga memiliki kemampuan sebagai antioksidan Robinson et al. 1993. Kerusakan DNA yang diakibatkan oleh cekaman oksidatif
mengalami penurunan dengan meningkatnya level metallothionein. Selama tiga dekade berikutnya, protein metallothionein telah berhasil diidentifikasi pada
semua makhluk hidup, termasuk hewan, cyanobacteria, fungi, dan tanaman tingkat tinggi Cobbett dan Goldsbrough 2002.
Struktur yang mirip metallothionein pada protein tanaman pertama kali diidentifikasi pada protein E
c
gandum dan gen yang menyandi protein mirip
10
metallothionein ini berhasil diisolasi oleh Kawashima pada tahun 1992, gen ini terletak dikromosom gandum hexaploid 1A, 1B dan 1D Robinson et al. 1993.
Protein metallothionein dari beberapa spesies tanaman ditunjukkan pada Gambar 3. Posisi residu sistein dengan motif khusus Cys-Xaa-Cys menunjukkan
bahwa protein ini memiliki kemampuan mengikat ion logam, sehingga protein ini memiliki peranan dalam metabolisme logam Robinson et al. 1993.
Gambar 3 Urutan asam amino metallothionein dari tanaman yang memiliki kesamaan dengan protein E
c
. Distribusi residu sistein -ditandai dengan warna merah- Robinson et al. 1993.
Berdasarkan posisi residu sistein protein metallothionein dikelompokkan menjadi dua tipe yaitu tipe 1 dan 2 Gambar 3. Tipe 1 memiliki motif Cys-Xaa-
Cys sedangkan pada tipe 2 memiliki motif Cys-Cys dan sepasang Cys-Xaa-Xaa- Cys dalam domain N-terminal Robinson et al. 1993.
Klasifikasi protein metallothionein disusun berdasarkan susunan residu asam amino sistein, yang sebagian besar residu sistein dalam metallothionein akan
membentuk suatu mercaptide dengan sejumlah logam. Hal ini dikarenakan sistein memiliki komposisi organosulfur yaitu group karbon yang berikatan dengan
sulfurhidroksil C-SH atau R-SH disebut juga thiol, yang memiliki afinitas sulfur tinggi yang dapat mengikat ion logam toksik. Gugus thiol ini sangat penting pada
proses biologi seperti pembentukan protein melalui ikatan disulfida, struktur protein tersier dan kuarter dan mekanisme terhadap ion logam berat. Menurut
Cobbet dan Goldsbrough 2002, protein metallothionein pada tanaman terbagi ke dalam empat kategori berdasarkan sekuen asam aminonya. Untuk tipe 1 dan 2
mengikuti klasifikasi Robinson et al. 1993, sedangkan metallothionein tipe 3 diekspresikan pada saat pematangan buah, dan tipe 4 sebagai contoh adalah
protein Ec pada gandum.
11
Metallothionein tipe 1 tersusun dari enam motif Cys-Xaa-Cys dimana Xaa adalah asam amino lain, yang terdistribusi secara merata dalam dua domain.
Kebanyakan metallothionein tipe 1, terdiri dari dua domain dipisahkan oleh ± 40 asam amino termasuk asam amino aromatik, namun terdapat juga domain kaya
sistein yang dipisahkan ± 10 asam amino, yang tidak termasuk residu aromatik dalam MT tipe 1 dari beberapa Brassicaceae Cobbet dan Goldsbrough 2002.
Metallothionein tipe 2 terdiri dari dua domain yang dipisahkan oleh ± 40 residu asam amino, pada pasangan sistein pertama terdapat motif Cys-Cys pada
asam amino posisi 3 dan 4 dari protein ini. Motif Cys-Gly-Gly-Cys terdapat di ujung dari N terminal domain yang kaya sistein. Untuk metallothionein tipe 3,
hanya terdiri dari empat residu sistein pada domain N terminal. Konsensus untuk tiga sistein pertama memiliki motif Cys-Gly-Asn-Cys-Asp-Cys. Sedangkan sistein
yang tipe 4 memiliki motif yaitu Gln-Cys-Xaa-Lys-Lys-Gly. Metallothionein tipe 4 berbeda dengan metallothionein tipe yang lain, yaitu memiliki tiga domain kaya
sistein, masing-masing memiliki 5 atau 6 residu sistein yang terkonservasi Cobbet dan Goldsbrough 2002.
Isolasi dan pengklonan gen-gen mengkode protein metallothionein telah dilakukan sejak lama, pertama kali dilakukan oleh Miranda et al. tahun 1990 pada
tanaman Mimulus guttatus dan jagung Framond 1991. Semua gen yang mengkodekan protein ini memiliki dua domain yang kaya sistein dengan motif
Cys-Xaa-Cys dimana Xaa adalah asam amino selain sistein Robinson et al. 1993. Sampai saat ini isolasi dan pengklonan gen penyandi metallothionein
masih terus berlangsung, untuk kelompok Angiospermae termasuk Arabidopsis, padi dan tebu memiliki keempat tipe dari gen metallothionein Cobbet dan
Goldsbrough 2002, Helianthus tuberosus Chang et al. 2002, Prosopis juliflora Usha et al. 2009 dan Colocassia esculentum Parmar et al. 2012.
Studi detail
pada tanaman
menunjukkan bahwa
fungsi protein
metallothionein tidak saja pada metabolisme dan detoksifikasi logam Hall 2001; Cobbett dan Goldsbrough 2002 tetapi juga ikut terlibat dalam berbagai proses
biologi seperti apotosis, pertumbuhan, perkembangan embrio, perkembangan mikrospora, senessense, pematangan, perkembangan buah dan respon terhadap
stres Cobbett dan Goldsbrough 2002; Lee et al. 2004; Ahn et al. 2011; Jia et al. 2012, selain itu berperan dalam pertumbuhan sel, proliferasi sel, aktivitas
metalloenzim dan faktor transkripsi Palmiter 2004; Haq et al. 2003, dan merupakan scavenger spesies oksigen reaktif ROS Wong et al. 2004.
Informasi mengenai ekspresi gen metallothionein pada berbagai tanaman ditunjukkan pada Tabel 3. Analisis pola ekspresi dapat membantu untuk
mengungkapkan kemungkinan fungsi biologi dari gen Metallothionein, misalnya gen Metallothionein pada gandum Ec dan barley diekspresikan pada tahap
perkembangan benih, sedangkan metallothionein pada kedelai diekspresikan lebih kuat pada daun dibandingkan di bagian akar. Untuk pea, Mimulus, dan jagung
diekspresikan pada perkembangan akar Robinson et al. 1993. Ekspresi gen Metallothionein pada tanaman diregulasi oleh berbagai faktor antara lain: ion-ion
logam, cekaman abiotik antara lain: cekaman osmotik, temperatur rendah, heat shock, serta serangan patogen Hsieh et al. 1996; Wong et al. 2004; Jin et al.
2006; Usha et al. 2009; Jia et al. 2012. Mekanisme metallothionein pada tanaman ditunjukkan pada Gambar 4 Jia et al. 2012.
12
Famili gen Metallothionein juga terdapat pada padi. Hsieh et al. 1995 berhasil mengisolasi gen metallothionein dari pustaka genom Oryza sativa. Gen
metallothionein yang terdiri dari 2 ekson dan 1 intron. Protein yang disandikan oleh gen ini terdiri dari 72 asam amino yang terinduksi oleh cekaman
pengurangan sukrosa dan tembaga. Metallothionein terekspresi kuat diberbagai organ padi. Gen OsMT1 dan OsMT2 telah isolasi dari cDNA metallothionein.
Peran gen OsMT2 lebih kompleks dibandingkan OsMT1 yaitu berperan dalam respon sel terhadap berbagai cekaman, OsMT2 terekspresi oleh cekaman sukrosa,
heat shock, dan asam abscisic, sedangkan OsMT1 terinduksi oleh logam tembaga Hsieh et al. 1996.
Tabel 3 Ekspresi gen metallothionein pada beberapa tanaman Robinson et al.1993
Gambar 4 Model mekanisme aksi metallothionein pada tanaman Jia et al. 2012 Gen OsMT2b berperan menangkap spesies oksigen reaktif reactive oxygen
spesies dan homeostatis logam, regulasi ekspresi gen OsMT2b secara sinergis oleh OsRac1 dapat mengurangi serangan blast pada tanaman padi Wong et al.
2004. Fukuzawa et al. 2004 telah mengisolasi gen Metallothionein tipe 4 ricMT dari padi yang terekspresi kuat di batang, promotor ricMT terekspresi
sangat kuat pada tanaman transgenik kecuali di endosperm.
13
Lengkapnya analisis sekuen genom padi dengan keterangan 37500 gen yang menjadi fokus perhatian pada analisis molekular berasal dari famili gen MT Zhou
et al. 2006. Analisis yang menyeluruh dari sekuen genom padi menunjukkan ada 11 gen yang menyandikan metallothionein padi OsMt, ini mengindikasikan
bahwa OsMt merupakan famili gen pada genom padi. Famili gen MT padi diklasifikasikan kedalam dua kelas, kelas satu dibagi kedalam empat tipe yang
berdasarkan kemiripan skuen dan hubungan filogenetik, sedangkan kelas dua berdasarkan pola susunan residu sistein, gen Metallothionein pada padi
ditunjukkan pada Tabel 4. Ekspresi dari tiap gen dalam famili gen OsMt memperlihatkan perbedaan, tidak hanya pada sekuennya tetapi juga pada pola
ekspresi dari jaringannya Zhou et al. 2006.
Tabel 4 Gen Metallothionein pada padi Zhou et al. 2006
a
nomor aksesi GenBank untuk setiap gen;
b
mengindikasikan lokasi dari posisi nukleotida pertama dan terakhir untuk setiap gen dalam kromosom;
c
tanda kurung menunjukkan nama sebelumnya; tanda bintang menunjukkan metallothionein baru dari pencarian database.
Saat ini, gen Metallothionein telah banyak diisolasi dari berbagai jenis tanaman dan diekspresikan didalam berbagai jaringan maupun organ seperti pada
akar, batang, daun, biji, dan buah dari berbagai spesies tanaman yang berbeda, ini bertujuan untuk meningkatkan nilai suatu tanaman, terutama tanaman budidaya.
Gen Metallothionein dari berbagai organisme dengan bentuk yang sesuai dengan asosiasi ion-ion logam telah diekspresikan dalam E. coli dan yeast Lee et
al. 2004, Arabidopsis t. Robinson et al.1996; Guo et al. 2003; Ahn et al. 2011, Nicotiana benthamiana Anggraito et al. 2012, Avicennia mariana Huang dan
Wang 2010, padi Fukuzawa et al. 2004; Wong et al. 2004; Yang et al. 2009, kedelai Anggraito 2012 dan jatropa Siregar 2012.
Gen MaMt2 adalah gen penyandi metallothionein tipe 2 yang diisolasi dari tanaman Melastoma Malabathricum L dan berhasil diklon oleh Suharsono et al.
2009. Gen ini diduga memiliki sifat toleransi terhadap toksisitas aluminium pada tanah masam, hal ini berdasarkan kemampuan tanaman Melastoma affine
sekarang bernama Melastoma malabathricum L. dalam mengakumulasi Al. Tanaman ini dapat bertahan pada cekaman Al dengan konsentrasi Al 3,2 mM
Trisnaningrum 2009. Gen ini terdiri dari 246 pb dan mengkode 81 asam amino, dan memiliki 14 residu sistein dengan motif Cys-Cys, Cys-X-Cys, dan Cys-X-X-
Cys Suharsono et al. 2008, gen ini telah difusikan dengan promotor ubiquitin Anggraito et al. 2012.
14