BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Waktu dan Lokasi
Penelitian ini akan dilakukan pada bulan Februari 2014 hingga Oktober 2014 di Laboratorium Mikrobiologi FMIPA Universitas Sumatera Utara.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan petri, tabung reaksi, jarum ose, spatula, pipet volum, vortex, cawan petri, inkubator, autoklaf,
rak tabung reaksi, erlemeyer, gelas ukur, bunsen, hot plate, syringe, pH meter, neraca analitik, mikro pipet, oven, autoklaf, kulkas, mikrometer sekrup dan stirer.
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat BAL AK5, EK2, EK10, US4, US6, Salmonella thypimurium, E.coli dan Staphylococcus
aureus koleksi Laboratorium Mikrobiologi FMIPA USU, media Nutrient Agar NA, media
de Man’s Rogosa Sharpe Agar MRSA, media de Man’s Rogosa Sharpe Broth MRSB, media Plate Count Agar PCA, media Muller Hinton
Agar MHA, phosphate buffer saline PBS, buffer citrate, alginat, larutan
, , tepung kacang hijau, tepung gram, Inulin, gliserol, kertas
cakram, aquades steril, alkohol 70, spiritus, HCl 0,08M, HCl 1M, NaOH 1M dan NaCl fisiologis 0,85.
3.3 Rancangan Percobaan
Penelitian dilakukan secara deskriptif dengan 2 kali pengulangan dengan mengumpulkan data BAL potensial dalam menghambat pertumbuhan Salmonella
thypimurium, E.coli dan Staphylococcus aureus. Formulasi enkapsulan yang tepat diuji dengan mengamati viabilitas sel pada perlakuan masa simpan dan simulasi
asam lambung.
3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Penyegaran Kultur Bakteri Asam Laktat
Kultur bakteri asam laktat dari kultur cadangan diinokulasikan ke dalam media MRSA kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang. Bakteri asam
laktat masing-masing dis ubkultur pada media deMan’s Rogosa Sharpe Broth
MRSB pada suhu ruang.
3.4.2 Persiapan Kultur BAL
Universitas Sumatera Utara
Pemeriksaan kemurnian kultur BAL potensial dilakukan melalui pemeriksaan morfologi secara mikroskopik dengan bantuan metode pewarnaan
gram dan uji katalase. Metode pewarnaan mengacu pada Fardiaz 1989, yaitu preparat bakteri
yang telah dioleskan pada gelas objek, ditetesi dengan kristal violet dibiarkan selama 1 menit dan dibilas dengan aquades. Preparat dikeringudarakan kemudian
ditetesi dengan larutan lugol iodin selama 30 detik dan kembali dibilas dengan aquades. Preparat kemudian dikering udarakan, selanjutnya ditetesi dengan
alkohol 95 sebagai bahan pemucat selama 15 detik. Pewarnaan terakhir menggunakan safranin selama 1 menit, pembilasan dilakukan dengan auades,
preparat dikeringudarakan. Bakteri yang telah diwarnai diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 100x dengan bantuan immersion oil.
Metode pengujian katalase mengacu pada Mc faddin 1983, uji katalase dilakukan dengan meneteskan larutan
3 pada kultur muda umur 24 jam. Sifat reaksi terhadap uji katalase ditentukan dengan pemunculan gelembung gas
merupakan hasil positif terhadap pengujian. 3.4.3 Seleksi BAL Potensial
Dalam pengujian 5 isolat BAL koleksi Laboratorium Mikrobiologi FMIPA USU digunakan metode difusi kertas cakram Yuharman et al., 2002. Digunakan
kertas cakram kosong dengan diameter 6 mm. Cakram dimasukkan ke dalam cawan petri kosong steril. Kultur cair BAL dengan kepadatan sel 10
8
CFUmL dipipet sebanyak 20 µL selanjutnya diteteskan pada permukaan kertas cakram dan
ditunggu selama ± 1 jam hingga sel bakteri berdifusi ke dalam cakram. Sebanyak 10 ml media MHA dituangkan ke dalam beberapa petri steril
dan dibiarkan memadat. Cotton bud steril dicelupkan kedalam masing-masing suspensi biakan bakteri patogen Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan
Salmonella thypimurium masing-masing dengan kepadatan sel 10
8
CFUmL dan diusapkan perlahan-lahan pada permukaan media secara merata, selanjutnya
dibiarkan mengering pada suhu kamar selama beberapa menit. Dengan menggunakan pinset steril, cakram yang telah berisi sel BAL diletakkan secara
teratur pada permukaan media uji.
Kultur diinkubasi pada suhu optimum pertumbuhan ±37°C dalam inkubator selama 24 jam. Setelah masa inkubasi, diameter zona hambat daerah
bening di sekitar cakram diukur dengan menggunakan jangka sorong. Aktivitas BAL dapat dilihat dengan adanya zona hambat di sekitar cakram. Daerah bening
disekitar cakram menunjukkan uji positif. Isolat yang menunjukkan zona bening terbesar dinyatakan sebagai isolat potensial dan dilanjutkan ke uji berikutnya.
3.4.4 Pembuatan Kurva Pertumbuhan
Kategori