Waktu dan Lokasi Alat dan Bahan Rancangan Percobaan Pemeriksaan Kemurnian Kultur Bakteri Asam Laktat BAL

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Lokasi

Penelitian ini akan dilakukan pada bulan Februari 2014 hingga Oktober 2014 di Laboratorium Mikrobiologi FMIPA Universitas Sumatera Utara.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan petri, tabung reaksi, jarum ose, spatula, pipet volum, vortex, cawan petri, inkubator, autoklaf, rak tabung reaksi, erlemeyer, gelas ukur, bunsen, hot plate, syringe, pH meter, neraca analitik, mikro pipet, oven, autoklaf, kulkas, mikrometer sekrup dan stirer. Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat BAL AK5, EK2, EK10, US4, US6, Salmonella thypimurium, E.coli dan Staphylococcus aureus koleksi Laboratorium Mikrobiologi FMIPA USU, media Nutrient Agar NA, media de Man’s Rogosa Sharpe Agar MRSA, media de Man’s Rogosa Sharpe Broth MRSB, media Plate Count Agar PCA, media Muller Hinton Agar MHA, phosphate buffer saline PBS, buffer citrate, alginat, larutan , , tepung kacang hijau, tepung gram, Inulin, gliserol, kertas cakram, aquades steril, alkohol 70, spiritus, HCl 0,08M, HCl 1M, NaOH 1M dan NaCl fisiologis 0,85.

3.3 Rancangan Percobaan

Penelitian dilakukan secara deskriptif dengan 2 kali pengulangan dengan mengumpulkan data BAL potensial dalam menghambat pertumbuhan Salmonella thypimurium, E.coli dan Staphylococcus aureus. Formulasi enkapsulan yang tepat diuji dengan mengamati viabilitas sel pada perlakuan masa simpan dan simulasi asam lambung. 3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Penyegaran Kultur Bakteri Asam Laktat Kultur bakteri asam laktat dari kultur cadangan diinokulasikan ke dalam media MRSA kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang. Bakteri asam laktat masing-masing dis ubkultur pada media deMan’s Rogosa Sharpe Broth MRSB pada suhu ruang.

3.4.2 Persiapan Kultur BAL

Universitas Sumatera Utara Pemeriksaan kemurnian kultur BAL potensial dilakukan melalui pemeriksaan morfologi secara mikroskopik dengan bantuan metode pewarnaan gram dan uji katalase. Metode pewarnaan mengacu pada Fardiaz 1989, yaitu preparat bakteri yang telah dioleskan pada gelas objek, ditetesi dengan kristal violet dibiarkan selama 1 menit dan dibilas dengan aquades. Preparat dikeringudarakan kemudian ditetesi dengan larutan lugol iodin selama 30 detik dan kembali dibilas dengan aquades. Preparat kemudian dikering udarakan, selanjutnya ditetesi dengan alkohol 95 sebagai bahan pemucat selama 15 detik. Pewarnaan terakhir menggunakan safranin selama 1 menit, pembilasan dilakukan dengan auades, preparat dikeringudarakan. Bakteri yang telah diwarnai diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 100x dengan bantuan immersion oil. Metode pengujian katalase mengacu pada Mc faddin 1983, uji katalase dilakukan dengan meneteskan larutan 3 pada kultur muda umur 24 jam. Sifat reaksi terhadap uji katalase ditentukan dengan pemunculan gelembung gas merupakan hasil positif terhadap pengujian. 3.4.3 Seleksi BAL Potensial Dalam pengujian 5 isolat BAL koleksi Laboratorium Mikrobiologi FMIPA USU digunakan metode difusi kertas cakram Yuharman et al., 2002. Digunakan kertas cakram kosong dengan diameter 6 mm. Cakram dimasukkan ke dalam cawan petri kosong steril. Kultur cair BAL dengan kepadatan sel 10 8 CFUmL dipipet sebanyak 20 µL selanjutnya diteteskan pada permukaan kertas cakram dan ditunggu selama ± 1 jam hingga sel bakteri berdifusi ke dalam cakram. Sebanyak 10 ml media MHA dituangkan ke dalam beberapa petri steril dan dibiarkan memadat. Cotton bud steril dicelupkan kedalam masing-masing suspensi biakan bakteri patogen Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Salmonella thypimurium masing-masing dengan kepadatan sel 10 8 CFUmL dan diusapkan perlahan-lahan pada permukaan media secara merata, selanjutnya dibiarkan mengering pada suhu kamar selama beberapa menit. Dengan menggunakan pinset steril, cakram yang telah berisi sel BAL diletakkan secara teratur pada permukaan media uji. Kultur diinkubasi pada suhu optimum pertumbuhan ±37°C dalam inkubator selama 24 jam. Setelah masa inkubasi, diameter zona hambat daerah bening di sekitar cakram diukur dengan menggunakan jangka sorong. Aktivitas BAL dapat dilihat dengan adanya zona hambat di sekitar cakram. Daerah bening disekitar cakram menunjukkan uji positif. Isolat yang menunjukkan zona bening terbesar dinyatakan sebagai isolat potensial dan dilanjutkan ke uji berikutnya.

3.4.4 Pembuatan Kurva Pertumbuhan

Pembuatan kurva pertumbuhan BAL dilakukan dengan menggunakan medium MRSB dengan menggunakan metode Cappucino Sherman 1987 Universitas Sumatera Utara yang dimodifikasi. Sebelumnya dilakukan aktivasi terhadap isolat bakteri sebanyak tiga kali. Pertama, sebanyak 1 ose kultur kerja diinokulasi ke dalam 10 ml MRSB, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Kedua, sebanyak 1 mL kultur aktivasi pertama diinokulasikan ke dalam 9 mL MRSB. Ketiga, sebanyak 2 mL dari aktivasi kedua dimasukkan ke dalam 18 ml MRSB diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. 5 mL kultur dari Erlenmeyer pada aktivasi ketiga dipindahkan ke dalam Erlenmeyer yang berisi 45 mL MRSB dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Kerapatan optik optical densityOD biakan tersebut diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang ƛ 520 nm. Jika OD-nya telah mencapai 0.5 maka biakan tersebut memenuhi syarat sebagai inokulum untuk membuat kurva pertumbuhan. Pembuatan kurva pertumbuhan diawali dengan memasukkan 10 mL 10 vv inokulum yang telah diketahui kerapatan optiknya ke dalam 90 mL MRSB dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C dilakukan dua perlakuan dalam inkubasi bakteri, dimana perlakuan pertama tanpa shaker dan perlakuan kedua dengan shaker. Kurva pertumbuhan dibuat dengan mengukur kerapatan optik dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang ƛ 520 nm setiap 1 jam selama 24 jam hingga mencapai fase stasioner yang ditandai dengan stabilnya nilai OD. Dari hasil penghitungan koloni dan kerapatan optik dialurkan sebagai kurva dengan sumbu X menyatakan waktu inkubasi dan sumbu Y menyatakan, kerapatan optik. 3.4.5 Enkapsulasi dan Pengeringan Sinbiotik dengan teknik estruksi Enkapsulasi dan pengeringan sinbiotik dengan teknik ekstrusi dilakukan dengan menggunakan metode Reyed, 2007 yang dimodifikasi. Pembuatan sinbiotik terenkapsulasi dimulai dengan menumbuhkan isolat BAL potensial sebanyak 10 vv dalam MRSB deMan Ragosa Sharp Broth diinkubasi pada suhu 37 °C dan dipanen pada akhir fase logaritmik. Sel bakteri dipanen dengan cara disentrifus 4 °C selama 20 menit pada 10.000 rpm. Sel bakteri dilarutkan pada 100 mL campuran yang terdiri atas tepung kacang hijau 2 bv, gliserol 5 vv, inulin 2 bv, dan Ca 0,1 bv, diperangkap selama 45 menit di dalam 100 mL larutan alginat steril dengan konsentrasi 3 bv. campuran tersebut diteteskankan pada Ca 0,1 M menggunakan syringe setelah satu jam gel dipindahkan ke dalam larutan fisiologis 0,85 untuk mendapatkan struktur gel yang kompak. Selanjutnya dilakukan pengeringan dengan metode Hot air oven pada suhu 45 °C selama 48 jam. Perlakuan kemudian diulangi dengan bahan tepung gram 2 bv, gliserol 5 vv, inulin 2 bv, dan Ca 0,1 bv.

3.4.6 Uji Viabilitas Sinbiotik BAL terenkapsulasi

Uji viabilitas dilakukan segera setelah proses enkapsulasi selesai dan setelah disimpan selama 1 bulan pada suhu 4 °C dan 27 °C. Viabilitas sel terenkapsulasi dihitung dengan menggunakan metode Total Plate Count pada Universitas Sumatera Utara media Plate Count Agar PCA pada pengenceran hingga dengan menggunakan buffer citrate; Zanjani et al., 2013. Satu gram dari BAL terenkapsulasi dimasukkan dalam 9 ml buffer citrate kemudian di vortex selama 15 menit, dibuat seri pengenceran dan dilakukan TPC pada media PCA, kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C. 3.4.7 Uji Ketahanan Sel Bebas dan Sinbiotik Terenkapsulasi Dalam Kondisi Asam Lambung Tiruan dan Kondisi Usus Tiruan Metode Woraharn et al., 2010 yang di modifikasi digunakan dalam uji ketahanan sel bebas dan sel terenkapsulasi dalam kondisi asam lambung tiruan dan kondisi usus tiruan 0,08 M HCl dengan 0,2 wv NaCl; Rao et al., 1989 diuji dengan nilai pH 2 dan 6 diatur dengan menggunakan NaOH 1 M dan HCl 1M. Pada kondisi asam lambung tiruan dengan pH 2 sedangkan usus tiruan dengan pH 6. Sel bebas dalam larutan NaCl fisiologis 10 -8 -10 -9 CFUmL dan sel terenkapsulasi dimasukkan ke dalam larutan asam lambung tiruan Simulated Gastric Juice dan diinkubasi selama 120 menit pada suhu 37 o C kemudian di transfer sampel ke dalam larutan usus tiruan Simulated Intenstinal Fluid selama 180 menit pada suhu 37 o C. Dilakukan perhitungan TPC dalam media PCA pada menit ke 60, 120, 180, 240 dan 300, dibuat seri pengenceran dalam larutan Phospate Buffer Saline PBS pH 7,4 lalu diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Khusus sampel pada pH 2, larutan sampel dinetralkan dengan 1 M NaOH dan 1 M HCl segera setelah dikeluarkan dari inkubator. Perlakuan dilakukan duplo. Universitas Sumatera Utara

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Pemeriksaan Kemurnian Kultur Bakteri Asam Laktat BAL

Pemeriksaan kemurnian kultur bakteri dilakukan terhadap empat jenis isolat bakteri asam laktat asal tambak ikan di Medan Sumatera Utara yaitu AK1, AK3, EK2 dan US7 dengan asal isolat, usus ikan nila US, air kolam AK dan endapan kolam EK. Pemeriksaan dengan pewarnaan Gram dan uji katalase pada setiap isolat BAL disajikan pada Tabel 2. Tabel 2. Karakteristik Kultur Bakteri Asam Laktat Kode Isolat Pewarnaan Gram Bentuk Sel Uji Katalase AK1 Positif Batang Positif AK3 Positif Batang Positif EK2 Positif Batang Negatif US7 Positif Batang Positif Hasil pemeriksaan morfologi dengan pewarnaan Gram dan uji katalase diperoleh hasil yang seragam yaitu bentuk morfologis batang, Gram positif serta katalase positif kecuali isolat EK2 yang bersifat katalase negatif. Karakteristik isolat AK1, AK3, EK2 dan US7 murni berdasarkan profil fenotip seperti berdasarkan dinding sel bakteri melalui pewarnaan Gram serta bentuk dari masing-masing isolat BAL yang sudah diisolasi sebelumnya dari tambak ikan di Sumatera Utara Harahap, 2013; Mayasari, 2013; Sitepu, 2013. Bakteri asam laktat merupakan bakteri Gram positif yaitu mampu mempertahankan warna kristal violet sehingga tetap berwarna ungu setelah diberi warna tandingan yaitu safranin yang berwarna merah. Bakteri Gram positif mempunyai dinding sel yang tebal tersusun dari lapisan peptidoglikan yang terdiri atas protein, asam teikoat dan polisakarida serta bagian luar dikelilingi dan dibungkus oleh lapisan sulfur protein Delcour et al., 1999. Pada uji katalase terhadap 4 isolat BAL hanya isolat US7 yang menunjukkan katalase negatif. Hal ini menunjukkan bakteri mampu menghasilkan enzim katalase untuk mengurai H 2 O 2 menjadi H 2 O dan O 2 . BAL merupakan Universitas Sumatera Utara mikroorganisme Gram positif, tidak membentuk spora, katalase-negatif yang tidak memiliki sitokrom dan anaerobik namun aerotoleran. BAL toleran terhadap asam, dan melakukan homofermentasi maupun heterofermentasi, asam laktat adalah produk akhir utama dari fermentasi gula Axelsson, 1998. Namun, beberapa spesies dapat membentuk katalase atau sitokrom pada media yang mengandung hematin atau senyawa terkait dan beberapa lactobacilli juga dapat menghasilkan non-heme katalase, yang disebut pseudocatalase, yang menyebabkan kebingungan untuk identifikasi BAL Holzapfel et al., 2001. Beberapa penelitian yang telah dilakukan menunjukkan hasil yang sama dengan penelitian ini dimana ditemukan BAL yang menghasilkan Katalase positif. Menurut Orla-Jensen 1950 pada penelitian pada mikroflora keju Cheddar, telah ditemukan strain Lactobacillus yang memiliki aktivitas katalase kuat dan lemah. Tiga strain Lactobacillus plantarum, yang diisolasi oleh Sherwood dari keju Cheddar yang berasal dari Selandia Baru, ditemukan katalase-positif. Dua dari strain memberikan reaksi katalase yang kuat sedangkan strain lainnya jauh lebih lemah Sherwood, 1939. Beberapa BAL menghasilkan hidrogen peroksida dalam kondisi pertumbuhan aerobik dan karena kurangnya katalase seluler, pseudokatalase atau peroksidase, mereka melepaskannya ke lingkungan untuk melindungi diri dari patogen sebagai bagian dari tindakan antimikroba. merupakan oksidator kuat dan dapat mengoksidasi gugus -SH protein membran bakteri Gram-negatif, yang sangat rentan Ray, 2004.

4.2 Seleksi BAL Potensial Sebagai Kandidat Probiotik