Pembuatan Kurva Pertumbuhan Prosedur Penelitian .1 Penyegaran Kultur Bakteri Asam Laktat

Pemeriksaan kemurnian kultur BAL potensial dilakukan melalui pemeriksaan morfologi secara mikroskopik dengan bantuan metode pewarnaan gram dan uji katalase. Metode pewarnaan mengacu pada Fardiaz 1989, yaitu preparat bakteri yang telah dioleskan pada gelas objek, ditetesi dengan kristal violet dibiarkan selama 1 menit dan dibilas dengan aquades. Preparat dikeringudarakan kemudian ditetesi dengan larutan lugol iodin selama 30 detik dan kembali dibilas dengan aquades. Preparat kemudian dikering udarakan, selanjutnya ditetesi dengan alkohol 95 sebagai bahan pemucat selama 15 detik. Pewarnaan terakhir menggunakan safranin selama 1 menit, pembilasan dilakukan dengan auades, preparat dikeringudarakan. Bakteri yang telah diwarnai diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 100x dengan bantuan immersion oil. Metode pengujian katalase mengacu pada Mc faddin 1983, uji katalase dilakukan dengan meneteskan larutan 3 pada kultur muda umur 24 jam. Sifat reaksi terhadap uji katalase ditentukan dengan pemunculan gelembung gas merupakan hasil positif terhadap pengujian. 3.4.3 Seleksi BAL Potensial Dalam pengujian 5 isolat BAL koleksi Laboratorium Mikrobiologi FMIPA USU digunakan metode difusi kertas cakram Yuharman et al., 2002. Digunakan kertas cakram kosong dengan diameter 6 mm. Cakram dimasukkan ke dalam cawan petri kosong steril. Kultur cair BAL dengan kepadatan sel 10 8 CFUmL dipipet sebanyak 20 µL selanjutnya diteteskan pada permukaan kertas cakram dan ditunggu selama ± 1 jam hingga sel bakteri berdifusi ke dalam cakram. Sebanyak 10 ml media MHA dituangkan ke dalam beberapa petri steril dan dibiarkan memadat. Cotton bud steril dicelupkan kedalam masing-masing suspensi biakan bakteri patogen Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Salmonella thypimurium masing-masing dengan kepadatan sel 10 8 CFUmL dan diusapkan perlahan-lahan pada permukaan media secara merata, selanjutnya dibiarkan mengering pada suhu kamar selama beberapa menit. Dengan menggunakan pinset steril, cakram yang telah berisi sel BAL diletakkan secara teratur pada permukaan media uji. Kultur diinkubasi pada suhu optimum pertumbuhan ±37°C dalam inkubator selama 24 jam. Setelah masa inkubasi, diameter zona hambat daerah bening di sekitar cakram diukur dengan menggunakan jangka sorong. Aktivitas BAL dapat dilihat dengan adanya zona hambat di sekitar cakram. Daerah bening disekitar cakram menunjukkan uji positif. Isolat yang menunjukkan zona bening terbesar dinyatakan sebagai isolat potensial dan dilanjutkan ke uji berikutnya.

3.4.4 Pembuatan Kurva Pertumbuhan

Pembuatan kurva pertumbuhan BAL dilakukan dengan menggunakan medium MRSB dengan menggunakan metode Cappucino Sherman 1987 Universitas Sumatera Utara yang dimodifikasi. Sebelumnya dilakukan aktivasi terhadap isolat bakteri sebanyak tiga kali. Pertama, sebanyak 1 ose kultur kerja diinokulasi ke dalam 10 ml MRSB, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Kedua, sebanyak 1 mL kultur aktivasi pertama diinokulasikan ke dalam 9 mL MRSB. Ketiga, sebanyak 2 mL dari aktivasi kedua dimasukkan ke dalam 18 ml MRSB diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. 5 mL kultur dari Erlenmeyer pada aktivasi ketiga dipindahkan ke dalam Erlenmeyer yang berisi 45 mL MRSB dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Kerapatan optik optical densityOD biakan tersebut diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang ƛ 520 nm. Jika OD-nya telah mencapai 0.5 maka biakan tersebut memenuhi syarat sebagai inokulum untuk membuat kurva pertumbuhan. Pembuatan kurva pertumbuhan diawali dengan memasukkan 10 mL 10 vv inokulum yang telah diketahui kerapatan optiknya ke dalam 90 mL MRSB dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C dilakukan dua perlakuan dalam inkubasi bakteri, dimana perlakuan pertama tanpa shaker dan perlakuan kedua dengan shaker. Kurva pertumbuhan dibuat dengan mengukur kerapatan optik dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang ƛ 520 nm setiap 1 jam selama 24 jam hingga mencapai fase stasioner yang ditandai dengan stabilnya nilai OD. Dari hasil penghitungan koloni dan kerapatan optik dialurkan sebagai kurva dengan sumbu X menyatakan waktu inkubasi dan sumbu Y menyatakan, kerapatan optik. 3.4.5 Enkapsulasi dan Pengeringan Sinbiotik dengan teknik estruksi Enkapsulasi dan pengeringan sinbiotik dengan teknik ekstrusi dilakukan dengan menggunakan metode Reyed, 2007 yang dimodifikasi. Pembuatan sinbiotik terenkapsulasi dimulai dengan menumbuhkan isolat BAL potensial sebanyak 10 vv dalam MRSB deMan Ragosa Sharp Broth diinkubasi pada suhu 37 °C dan dipanen pada akhir fase logaritmik. Sel bakteri dipanen dengan cara disentrifus 4 °C selama 20 menit pada 10.000 rpm. Sel bakteri dilarutkan pada 100 mL campuran yang terdiri atas tepung kacang hijau 2 bv, gliserol 5 vv, inulin 2 bv, dan Ca 0,1 bv, diperangkap selama 45 menit di dalam 100 mL larutan alginat steril dengan konsentrasi 3 bv. campuran tersebut diteteskankan pada Ca 0,1 M menggunakan syringe setelah satu jam gel dipindahkan ke dalam larutan fisiologis 0,85 untuk mendapatkan struktur gel yang kompak. Selanjutnya dilakukan pengeringan dengan metode Hot air oven pada suhu 45 °C selama 48 jam. Perlakuan kemudian diulangi dengan bahan tepung gram 2 bv, gliserol 5 vv, inulin 2 bv, dan Ca 0,1 bv.

3.4.6 Uji Viabilitas Sinbiotik BAL terenkapsulasi