Optimasi PCR dan analisis migrasi produk PCR
12.3.3 Optimasi PCR dan analisis migrasi produk PCR
Optimasi PCR dilakukan untuk mendapatkan pita tunggal spesifik di ukuran basa yang diinginkan agar diperoleh hasil sekuensing yang baik. Dalam penelitian ini, ukuran basa yang diinginkan adalah 1011 pasang basa. Optimasi ini dilakukan dengan mengoptimalkan kondisi, konsentrasi dan komposisi PCR. Produk PCR kemudian dianalisis migrasi dengan elektroforesis DNA agarose 1% dan menghasilkan satu pita tunggal spesifik di ukuran sekitar 1000bp. Produk ini selanjutnya disebut sebagai OPN I (Yueniwati Y., 2012).
Hasil PCR OPN I tersebut adalah sebagai berikut. 12 345 678
1500 bp 1000 bp
800 bp
600 bp Keterangan:
500 bp 400 bp No.1-6: Sampel; 300 bp 200 bp No.7: Kontrol negatif; 100 bp No.8: DNA Marker
Sumber: Yueniwati Y., 2012
Gambar 12.19 Elektroforegram hasil PCR OPN I
Namun, pada optimasi selanjutnya tidak ada pita yang ter- bentuk, baik di daerah target maupun di daerah lainnya. Optimasi dilanjutkan menggunakan sampel yang pernah berhasil dengan kondisi dan komposisi yang sama namun tidak ada pita yang
Bab 12 – Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Variasi Genetika
1500 bp 1000 bp
100 bp No.1-6: Sampel; No.7: DNA Marker
Sumber: Yueniwati Y., 2012
Gambar 12.20 Elektroforegram DNA Template
Berdasarkan hasil analisis migrasi di atas, DNA template masih dapat dikatakan baik dan layak untuk diamplifikasi.
Ringkasan hasil optimasi OPN I dapat dilihat dalam tabel berikut ini (Yueniwati Y., 2012).
Tabel 12.6 Optimasi PCR untuk amplifikasi gen target OPN menggunakan master mix OPN I
Parameter
Optimasi ke-
yang dioptimasi
I II III
IV V VI VII VIII IX
Volume DNA 1 1 1 1 1 1 1 1 template (ul)
Dilakukan
Volume Primer
1 1 1 1 elektroforesis
R/F (ul)
DNA template
1 1 1 (Aliquot 1 baru)
Volume master 10 10 10 10 10 10 10 (Aliquot 10 mix
baru) Hasil
Negatif Negatif Negatif Negatif 1000bp
1 pita di 1 pita di
Negatif Negatif DNA template
1000bp
masih dalam kondisi baik
Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Ultrasonografi ...
Optimasi selanjutnya dilakukan pada sampel yang pernah berhasil teramplifikasi dan masih dalam kondisi baik berdasarkan hasil elektroforesis. Optimasi ini menggunakan Pfu DNA polimerase dan buffer baru (Pfu Promega). Hasilnya, terbentuk beberapa pita yang tidak spesifik di daerah lain dan ada sisa primer (primer dimer) yang menunjukkan sampel tidak teramplifikasi dengan baik sehingga suhu annealing dinaikkan dari 55°C menjadi 57°C agar produk yang dihasilkan lebih spesifik. Namun, hanya terbentuk primer dimer (Yueniwati Y., 2012).
Suhu annealing kemudian diturunkan menjadi 54°C dengan harapan muncul pita di daerah target. Kondisi inipun tidak berhasil. Selanjutnya, volume DNA template dinaikkan dari 1 ul menjadi 2 ul dengan tujuan meningkatkan kemungkinan menempelnya primer pada template. Optimasi dilanjutkan dengan menurunkan kembali suhu annealing menjadi 50°C agar pita yang muncul lebih tebal. Produk PCR ini selanjutnya disebut dengan OPN II (Yueniwati Y., 2012).
Hasil optimasi PCR OPN II diringkas dalam tabel berikut (Yueniwati Y., 2012).
Tabel 12.7 Optimasi PCR menggunakan Pfu DNA polimerase OPN II
Parameter yang Optimasi ke- dioptimasi
X XI XII
XIII XIV
0,32 0,32 Volume Buffer (ul)
Volume Pfu (ul)
2,5 2,5 Volume dNTP (ul
0,5 0,5 Volume Primer F/R (ul)
1 1 1 2 1 Volume DNA template (ul)
1 1 1 2 1 Suhu Annealing (°C)
55 57 54 54 50 Lama Elongasi (detik)
Negatif. Negatif. dan 300bp.
2 pita di 200 Negatif.
Negatif.
Hanya Hanya Terbentuk
Hanya
Hanya
terbentuk terbentuk primer
terbentuk terbentuk
primer primer dimer
dimer dimer
Optimasi kembali dilakukan menggunakan dNTP baru sebagai salah satu komponen utama untuk mensintesis untai DNA komplementer, menaikkan suhu annealing menjadi 55°C dan memperpanjang waktu predenaturasi menjadi 5 menit agar denaturasi lebih sempurna sehingga meningkatkan jumlah tempat
Bab 12 – Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Variasi Genetika
241
penempelan primer. Karena masih belum mendapatkan kondisi yang optimal, optimasi dilanjutkan dengan menurunkan kembali waktu predenaturasi menjadi 2 menit. Waktu predenaturasi yang telalu lama dapat merusak kondisi sampel. Selain itu, ditambahkan pula enhancing agent yaitu gliserol dengan final concentration 5% untuk meningkatkan spesifitas dan ketebalan pita. Volume primer juga dinaikkan dari 1 ul menjadi 1,5 ul dengan volume DNA template 1 ul. Dengan kondisi ini, didapatkan pita tipis di daerah 200bp dan masih terbentuk primer dimer. Oleh karena itu, volume DNA template kembali dinaikkan menjadi 2 ul agar pita yang terbentuk menjadi lebih tebal. Hasilnya, sisa primer lebih tebal dan tidak ada pita yang muncul di daerah target maupun daerah lain sehingga suhu annealing kembali diturunkan menjadi 50°C dengan harapan terbentuk pita yang lebih banyak. Pada kondisi ini, terbentuk pita di daerah 300bp dan smear di daerah lain sehingga pada optimasi selanjutnya suhu annealing diturunkan menjadi 45°C. Tujuannya agar meningkatkan jumlah pita yang terbentuk, khususnya di daerah target. Namun, hanya terbentuk primer dimer. Suhu annealing kemudian ditingkatkan menjadi 48°C dan mengganti gliserol 5% dengan DMSO 5%. DMSO juga merupakan enhancing agent yang dapat meningkatkan spesifitas dan ketebalan pita produk PCR. Akan tetapi, pita juga tidak terbentuk pada kondisi ini. Produk PCR dengan dNTP baru ini disebut sebagai OPN III. Tabel 12.8 merupakan ringkasan hasil PCR OPN III (Yueniwati Y., 2012).
Optimasi diulang dengan meningkatkan suhu annealing menjadi 50°C. Karena tetap tidak berhasil, optimasi dicoba dengan menggunakan master mix baru Taq DNA Polimerase (Promega) dengan suhu annealing 55°C yang disebut sebagai OPN IV. Namun tidak ada produk PCR yang dihasilkan(Yueniwati Y., 2012).
Optimasi selanjutnya adalah mengganti master mix dengan master mix Taq DNA Polymerase Intron. Konsentrasi dan kondisi PCR disesuaikan dengan master mix yang baru. Suhu annealing yang digunakan adalah 54. Dengan optimasi ini, didapatkan pita tunggal yang spesifik di daerah target yaitu di 1000bp. Namun, masih terbentuk smear dan sisa primer sehingga dilakukan optimasi ulang dengan mengubah suhu annealing menjadi 56; 54,5; 54 dan
Deteksi Dini Stroke Iskemia dengan Pemeriksaan Ultrasonografi ...
Bab 12 – De Tabel 12.8 Optimasi PCR menggunakan dNTP baru OPN III
Optimasi ke-
Parameter yang dioptimasi tek
XI XXIII XXIV si Dini Str
Volume Pfu (ul)
0,5 0,5 0,5 Volume Buffer (ul)
Volume dNTP baru (ul)
1 1 1 1 1 emia de
Volume Primer F/R (ul)
Volume DNA template (ul) 1 1 2 1 2 1 1 1 1
Dilakukan
55 55 50 45 48 50 ng an P
Suhu Annealing (°C)
50 55 55 elektroforesis
2 2 2 2 2 2 emerik
Lama Elongasi (menit)
2 2 2 DNA Template
Lama Predenaturasi (menit) 2 5 2 2 2 2 2 2 2 Penambahan Gliserol final
1,25 - - saan V
concentration 5% (ul) Penambahan DMSO final
- 1,25 1,25 ariasi Ge
concentration 5% (ul)
Negatif. Negatif. ne
tipis di
tipis di
DNA template
Hanya Hanya
tik Hasil
masih dalam
Sisa
300bp.
terbentuk terbentuk a
kondisi baik
Masih
ada sisa
primer
Masih
primer primer
ada sisa
dimer dimer
tebal.
primer
53. Harapannya pita yang terbentuk di daerah target menjadi lebih tebal. Akan tetapi, setelah dilakukan percobaan, ternyata kondisi paling optimal adalah pada suhu 54. Untuk sampel yang belum menghasilkan produk, volume sampel ditingkatkan menjadi 2 ul dengan kondisi yang sama. Hasil PCR ini disebut sebagai OPN V seperti yang tampak pada gambar berikut ini.
1500 bp 1000 bp
800 bp 600 bp 500 bp
400 bp Keterangan:
300 bp 200 bp No. 1: DNA marker; 100 bp No. 2: Kontrol negatif;
No. 3-14: Sampel Sumber: Yueniwati Y., 2012
Gambar 12.21 Elektroforegram hasil PCR OPN V
Hasil ringkasan optimasi PCR OPN V dapat dilihat pada Tabel 12.9.